d*****r
发帖数: 45 | 1 我们一直用 Stratagene's QuikChange "XL" Mutagenesis Kit 做single mutaion，
最近想试试看别的pfu，发现pfu啊，dNTP啊什么的都可以换掉
但是 stratagene kit里的 "quick solution"还是很有必要加的
说明书里没有写这个buffer成份是什么
google了一下有人猜就是pure DMSO，不知道真的假的
请问有人知道吗？谢谢！ |
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t***u
发帖数: 230 | 2 You don't need 5' phosphorylated primers if you are only going to use one set
of complementary primers. If you are using multiple primers to introduce
multiple changes simultaneously, then you need to phosphorylate the 5'.
Please refer to the details in their manuals:
http://www.stratagene.com/manuals/200518.pdf
Here are a few personal comments on the Stratagene's Quickchange system:
1. NO NEED to buy their kit, it's very over-priced. You need to get a high
fidelity DNA polymerase (for example, |
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T**********t
发帖数: 1604 | 3 Stratagene的QuikChange Kit，我所有的mutants都是用这个kit做的。
Stratagene现在改名叫Agilent Genomics了。
自己PCR也行啊，用kit主要是方便，所有需要的东西都给你配好了，多省事。要不然你
不是还得另外买限制酶和感受态细胞么。 |
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l********m
发帖数: 73 | 4 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: liangmao (凉猫 窝里横 -,=), 信区: Biology
标 题: 问克隆高手：什么strain容易克隆unclonable的片段？
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Dec 15 12:43:18 2008)
偶在clone一些highly structured DNA segments, 不长，也就100bp左右
但是在DH5a里，测序发现大部分都只剩下10bp左右的一小段尾巴了。。。哭。。。
老板说可能是因为很多时候host不喜欢某些外源片段，特别是我这种highly
structured
很可能就发生deletion了
请问有哪位高人有这方面的经验吗？
知不知道什么strain比较能tolerant这种unstable segments？
我现在找到了stratagene的SURE 2, 不过stransformation efficiency 好像很低，还
是有很多不长
还有比sure 2更好的推荐吗？
谢谢啦～～ |
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R*s
发帖数: 2041 | 5 It's called QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit.
Just seach stratagene website for it.
It's very easy to use. One thing is they usually give little
Pfu turbo compared to the other reagents from the kit. So you'd
better buy some extra Pfu turbo yourself if you are doing a lot of this. |
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r****o
发帖数: 105 | 6 1 design primers of ~30 bp length.
2.Use good polymerase to do PCR (herculase from stratagene is great,
a Pfu with special buffer in it to increase the fidelity)
3. add 1~3 ul Dpn I directly to the PCR reaction tube. digest it
for at least 3 hours in 37 degree
4.Desalt the PCR sample with PCR purification kit from Qiagen.
5.Transform competent E.Coli.
6. Pick up several colonies , grow small cultures and do miniprep.
7. Send the DNA to sequencing. |
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R*s
发帖数: 2041 | 7 It's called QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit.
Just seach stratagene website for it.
It's very easy to use. One thing is they usually give little
Pfu turbo compared to the other reagents from the kit. So you'd
better buy some extra Pfu turbo yourself if you are doing a lot of this. |
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r****o
发帖数: 105 | 8 1 design primers of ~30 bp length.
2.Use good polymerase to do PCR (herculase from stratagene is great,
a Pfu with special buffer in it to increase the fidelity)
3. add 1~3 ul Dpn I directly to the PCR reaction tube. digest it
for at least 3 hours in 37 degree
4.Desalt the PCR sample with PCR purification kit from Qiagen.
5.Transform competent E.Coli.
6. Pick up several colonies , grow small cultures and do miniprep.
7. Send the DNA to sequencing. |
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r****o
发帖数: 105 | 9 Flag tag 最早来自于T7噬菌体十号基因表达产物11个氨基酸的前导序列。
现在公认的序列是：DYKDDDDK
这个标签的好处是一来比较小，二来比较亲水，所以一般不影响所标记蛋白
的活性。至於是在N还是C端，要看你蛋白的实际情况。比如有些蛋白N端或者C端要
经过蛋白酶切除，这种情况下FLAG显然不能加到要被切除的一端去。当然你也可以
两端都试试，加在哪端活性好，就用那端好了。
如果是N-terminus Flag，ATG应该加在FLAG前面，之前还应该有Kozak sequence,
以便翻译正确。不用隔太多氨基酸，用一两个glycine之类旋转比较灵活的氨基酸
隔开就行了。
如果你想省事，可以找商业化的有FLAG载体，比如Stratagene的
pCMV-Tag系列,既有N端FLAG的载体，又有C端FLAG的载体。又如SIGMA公司的pFLAG-CMV
系列，也是既有N端又有C端FLAG载体。SIGMA公司还提供一种特别的p3XFLAG-CMV系列，
加有三个串联的FLAG。如果你的蛋白做western检测起来信号很弱，加三个或者更多
FL |
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a*****n
发帖数: 2835 | 10 check stratagene website
they have a program for designing primers. I did a lot mutagenesis using
their program and system. |
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m******t
发帖数: 109 | 11 2 questions: i was provided 2 pairs of primers for 3 mutations by the
stratagene program. 1' i should use the MULTI kit cause there are several
kits. 2' should i do 1 or 2 PCR? thx |
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O******e
发帖数: 14 | 13 stb12? from which company? A simple search brought it to stratagene,but
nothing on their website. Thanks.
). |
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a********k
发帖数: 2273 | 14 Stratagene的Herculase II
在我手上比Invitrogen的platinum和pfx,neb的phusion要好
如果fidelity要求不是很高可以考虑clontech的advantage 2，产量绝对惊人 |
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b******n
发帖数: 4225 | 15 取决多长片段
我用stratagene 的pfu ultra，觉得还不错
至少4k片段不成问题 |
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H*g
发帖数: 2333 | 16 Stratagene Quikchange lightning Site-Directed Mutagenesis Kit |
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b******n
发帖数: 4225 | 17 好像stratagen的PfuUltra(TM) high-fidelity DNA polymerase还不错
我们做点突变一直用它
实在不行你可以分成两段做PCR |
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y****i
发帖数: 2194 | 18 Herculase from Stratagene,
great for long and high GC PCR |
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c*********u
发帖数: 3128 | 19 Could you please let me know the catalog # ?
The stratagen company seems disappeared. |
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g*****y
发帖数: 6325 | 20 wow, doing DNA work but don't know stratagene?? |
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s**x
发帖数: 138 | 21 我用的是stratagene kit。做了很多的mini prep，没问题的。今天我酶切了质粒。
mutate之前的事没问题的。可之后的就切不出任何bands。 明天我问问公司，看我是否
用错。 |
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L**********r
发帖数: 143 | 22 Can someone comment on qPCR systems from ABI, BioRad, Stratagene, Eppendorf,
Roche, and Cepheid;
regarding cost, analysis software, reliability, customer support, etc. |
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n***w
发帖数: 2405 | 23 用taq克隆了一段时间发现有突变，于是从stratagene买了pfu回来。。。
结果就杯具了。。。都摸了1周多条件了。。。
我要p的是cDNA，从公司买回来的vector。。。
primer1的Tm在55度，primer2的Tm在57度。。。于是我annealing temp用50度走。。。
看到instructions说amplify cDNA，要加Mg到3mM。。。
于是我就照做了，
那次很幸运，出现了条带，可是我再用同样的条件去重复，就是出不来条带。。。
唉。。。 |
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x**x
发帖数: 92 | 24 Mutagenesis help：请问如何插入一段 ~20bp的片段 （large vector+insert）？
Vector: 5kb
Insert: 4kb
total: 9kb
用Stratagene (agilent)的程序设计的引物。
试着用QuikChange XL kit, 不同的polymerase (PFU ultra, PrimeStar supermix, HF
PCR supermix), DMSO浓度。全都不行。
请大家给些建议， 谢谢。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 25 这个相比Stratagene quikchange没什么优势啊感觉，用过的给讲讲？
个人推荐Clonetech的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，如果要同时突变
多个位点的话。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 26 Cell signalling的做过western 没问题
以前Stratagene也卖过M2，不知道是哪儿来的。
Sigma最近的FLAG抗体烂得一塌糊涂，不知道现在哪家的还能用，millipore, cell
signaling, Thermo/pierce or genescript? |
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w*****a
发帖数: 37 | 27 不太想专门买Stratagene's "GlogosII" autorad marker ，又贵，还至少要买100条
，哪用得
了这么多。觉得实在没有必要。实验室也就俩个片盒，但压片没有荧光标记做对照也不
行。。
这里有买过有多余的吗？能送我俩条吗？以前实验室内用得很省，都剪成好几段用。。
多谢了各位，为了这个事愁死了。。 |
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n*****e
发帖数: 119 | 28 我的质粒23kb，qiagen小提大提都没有问题。但是xl-10gold细胞在我这不行，我用的
是stratagene的sure cell。
S1 |
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q*****d
发帖数: 445 | 30 最近要做library, 使用这个实验室的方法进行易错PCR
（http://www.msg.ucsf.edu/agard/Protocols/PCR_Random_Mutagenesis.htm），酶
是NEB的Taq,但是效果一直不是很好，35 cycle PCR的浓度还是很低，30cycle特别的少
，请问
大家有什么方法提高产量吗？还是我的方法不够好，谢谢大家。
PCR Random Mutagenesis
Materials
1. Parental plasmid
2. Oligos surrounding region to be mutagenized
3. Error-prone PCR buffer (10x is 100mM Tris-HCl, pH8.3; 500mM KCl,
70mM MgCl2, 0.1% (w/v) gelatin.)
4. 10mM MnCl2 (stock) (make sure there is no brown coloring to
stock soln; if there is it means... 阅读全帖 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 31 我就是用的BL21(DE3)pLysS strain，用0.4mM的IPTG诱导，表达4hr，蛋白产量很好。
T7 lysozyme是T7 RNA polymerase的natural inhibitor，它的表达是为了抑制在BL21(
DE3)里比较常见的leaky expression，但是这个表达量不至于抑制被IPTG诱导后的
expression。而且lysozyme不是蛋白酶，不可能降解你的蛋白。
你的蛋白如果用BL21(DE3)表达很好，说明你的蛋白对E.coli没有细胞毒性，你可以不
需要用BL21(DE3)pLysS来表达。
还有就是你看一下你用的是BL21系列还是BL21 Gold系列，这两个系列都有(DE3)和(DE3
)pLysS，但是我用BL21 Gold系列就碰到过表达不出来的问题。我说的BL21和BL21 Gold
都是Stratagene（现在的Agilent Genomics）的产品，不知道别的公司是不是也是这么
标识的。 |
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c**********6
发帖数: 1173 | 32 最近在做一些很简单的PCR。就是来amplify一些大概200mer的DNA library。
发现做完PCR以后总是会在管子里面发现好一些白色的沉淀。感觉这个很像是蛋白质，
但是我的template是合成的DNA，不存在蛋白质。难道这些沉淀是polymerase或者
buffer里面的BSA什么的（如果有BSA的话）
用的是Stratagene的Herculase.大家有类似的经验么？
谢谢 |
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b******n
发帖数: 4225 | 33 nod，Stratagene PfuUltra DNA polymerase 是个很好的选择 |
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b******n
发帖数: 4225 | 34 按照stratagene的说法，综合了fusion的快速和pfuUltra的准确
we couple the fusion polymerase technology with our engineered PfuUltra DNA
polymerase,** hotstart antibody, and proprietary ArchaeMaxx PCR enhancing
factor to achieve extreme accuracy, high specificity, and long
target-length capability while dramatically reducing overall PCR extension
times.
这玩意靠谱不？ |
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l*****a
发帖数: 1431 | 36 谢谢LS。是 stratagene anti-flag M2 antibody, Cat#200472 吗？ |
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Z******5
发帖数: 435 | 37 只有多试几条引物了。
但我做的和你不一样，我设计的引物用普通Taq或者即使是专门扩高GC的kit也有很多非
特异性的，但是用Real Time的kit就非常好。 顺便说一下我用的是Brilliant
Brilliant® II SYBR® Green QPCR Master Mix (Stratagene)
另外引物拿到后就不要用普通的试来试去了，没啥意义，直接找几种做Real Time的kit
上就行了。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 38 没用过这个系列的，不确定是否含质粒，从基因型看好像是插入基因组的(没有pXXX)，
建议你发个Email或者打电话问问Agilent (Stratagene)。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 39 以前没做过EP PCR，想通过这个方法改变一个蛋白质的底物偏好性。请问大家是用kit
呢还是自己配mix reaction呢？
看了一下clonetech的和Stratagene的kit,都至少要四五百刀。穷！大家还有啥好的推
荐没？
多谢！
定有包子酬谢！ |
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s******y
发帖数: 435 | 40 plasmid有多大，如果没超过8,9K的话，还是建议用Stratagene的那个QuickChange kit
，大不了就是做3次，顺利的话一周之内搞定。这篇paper提的方法倒是挺有意思，但是
不知道实际操作起来如何，以后如果有机会的话（比如碰到做大规模alanine screenin
g的时候）可以试试。
800
. |
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i***l
发帖数: 1656 | 41 nod
plasmid有多大，如果没超过8,9K的话，还是建议用Stratagene的那个QuickChange kit
，大不了就是做3次，顺利的话一周之内搞定。
this is well established, and commercially QCed
kit
screenin |
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C******d
发帖数: 362 | 42 刚做real-time PCR，遇见了一个大问题，待高手解答，先谢谢了！
我的样品没有扩增曲线，但gel显示band is there.
PCR 反应溶液组分：
DNA 2 uL, 50-150 ng， 260/280 都在1.8-2.1之间
taqman probe: 2 pmol
primers: 4 pmol
master mix: 10 ul
总共： 20 uL
real-time PCR 仪器是：Stratagene Mx3000
昨天和合成probe的公司联系，说可能要加DMSO，今天就加了5%，结果同样是没有扩增
曲线？
primer和probe，都是按文献设计做的。莫非是仪器设置的问题？还是其他莫名原因？
跪谢！！！！ |
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C******d
发帖数: 362 | 43 谢谢建议
机子是Stratagene Mx3000
设置，应该注意些什么？ |
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b**********8
发帖数: 349 | 44 要变两个base，CT to AA,用的stratagene的试剂盒，做了两次，每次挑5个克隆测序分
析，突变成功，但是每个克隆在突变位点之后大约20bp开始出现大片段的mismatch，测
序峰形都很好，到底是个什么情况？除了重新设计引物还有别的办法吗？ |
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d****h
发帖数: 46 | 45
GenemorphII stratagene |
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j***y
发帖数: 1640 | 46 是的
俺后来用 stratagene mutagenesis kit 带来的 XL1-blue heat shock 转化什么都没
有涨，再改用用电转化 就有蓝色菌株在 X-gal板涨出来 (vector 是带 Lacz alpha的） |
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b******n
发帖数: 4225 | 47 做过10kb的质粒点突变，赶进度做得不算很精细
土法上马
自己买的PfuUltra II HotStart Fusion DNA Polymerase(stratagene)和DpnI（NEB）
6个clone中2个成功突变了 |
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b**********8
发帖数: 349 | 48 借这个帖子问一下，用PfuUltra II HotStart Fusion DNA Polymerase(stratagene)和
DpnI（NEB），最多一次可以同时变几个碱基，因为自己要做一个shRNA resisitant
expression plasmid，需要每隔两个bp变一个，总共变4个，能否一次完成？还是要分
两步进行？ |
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b******n
发帖数: 4225 | 49 PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase
这个是stratagene用来做site-direct mutagenesis kit里面的
号称可以扩增20kb
我们一直用这个做高保真扩展，效果很不错
你有钱就多买几个DNA polymerase来试试 |
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s********n
发帖数: 2939 | 50 只是猜测：你这种情况可能像ls有人提到的，形成A-B active complex比较复杂，或者
不稳定，易形成aggregation。可以试试，
1）in vitro reconstitution, 用很低的浓度做试验（ug/ml）；A和B在高盐浓度下的
稳定性如何？如果稳定的话，你可以试试在高盐（1 M even higher）条件下做混合，
高盐可能可以降低non-specific interaction形成aggregation的几率；
2）in vivo，你可以试试用weak promoters表达你的蛋白（Aw+Bw, Aw+Bm, Am+Bw; w,
weak, m, medium），lower temperature，coexpress chaparones。
不过个人更倾向于试in vitro的方法，in vivo的local concentration太高了即使在
low expression的条件下。
BTW: Chaperone的plasmid可以买Takara (Clontech)和Agilent (Stratagene). |
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