S***6
发帖数: 431 | 1 Insert的基因全长4.6kb，载体3kb。
一开始用一种Fast cloning的方法，就是对载体和Insert都PCR，然后两个接头处保留
有16-18bp的overlap，混合后直接转化E.coli，这种方法在我们lab对于3kb一下的
subcloning都非常有效。可惜得到的是部分插入的克隆，只插进去N端的200bp和C端的1
.3kb，分析后怀疑是Insert的序列中包含6bp的重复序列，可能发生了self-
recombination。
现在回到传统的方法，PCR后先连接到T 载体，但是也还是得到部分插入的克隆，这次
插入的序列只有N端的大约1kb左右。
现在这个Insert只是从RT 产物中得到的PCR 片段，所以无法突变修改容易引起自我重
组的序列。
另外一个怀疑的地方是现在的连接酶太高效了，连接只需要5分钟到15分钟，这么高效
的连接是不是也很容易造成DNA片段内部的重组啊？形成一个Loop，然后一大段中间序
列就这样miss了。
大家帮我分析一下这种大片段丢失的现象究竟是Insert中含有容易自我重组的序列，还
是连接酶造成的？还是两个因素可能都发挥了作用？还是... 阅读全帖 |
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l******g
发帖数: 1145 | 2 50aa的tag的话，直接挂引物上有点太大了，我没有试过。
你要加的tag如果已经在其他质粒里的话，要么直接切，要么pcr带酶切位点扩增出来后
，先subcloning到lentivirus的表达载体里，一事两便，靠近5’和3’的msc各做一个
。5’的那个记得要有start codon。这两个质粒，以后可以用来放其他要tag的蛋白。
在克隆好带tag的lentivirus质粒后，再用pcr带酶切位点扩增你的目标蛋白，然后
subcloning进去。
注意：
1.在5’加tag的话，如果有现成酶切位点可以利用的话，可以直接subclone，不用pcr
的话，可以减少mutation的几率。
2. 3’加tag，扩增目标蛋白时，记得把stop codon去掉。
3.设计流程时，千万注意最后蛋白和tag是in frame的（连在后面的那个）！！ |
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E*********4
发帖数: 16 | 3 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
. 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA ta... 阅读全帖 |
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J*****w
发帖数: 180 | 4 我朋友正在帮国内厂家物色有领导能力的，有创业精神的专家，在国内药厂组建蛋白质
药物开发部。
A leading China Pharma Company has immediate openings for the following four
leadership positions in its Yantai, China and Singapore sites. Please send
your resume to [email protected] if interested.
Title: Head, Upstream Process Development
Functional Description:
Lead, build and develop a high performance Upstream Process Development
group engaged in mammalian cell culture development for commercial
therapeutic proteins, including subclone/clone sel... 阅读全帖 |
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J*******6
发帖数: 72 | 5 Can DNA be used for subcloning after use of EB substitutes ?
I once tried a EB substitutes and found the DNA can be be subcloned. It
wasted my 1 week time to found out this problem. |
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M*****n
发帖数: 16729 | 6 I need subclone a big promoter, which makes the plasmid over 30 kb.
What kind of bacterial strain should I use to propogate the plasmid and for
subcloning?
What kind of plasmid preparation kit should I use for the plasmid?
Thanks a lot for sharing your experience. |
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m******5
发帖数: 1383 | 7 请教一下subclone的问题，为什么说subclone效果会好呢？passing 更多代数了阿
karyotyping |
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Z**********g
发帖数: 222 | 8 不认为Next Gen Seq在未来可以解决cancer问题。
1.可以认为cancer是基因病，但这是个复杂的基因病。每个肿瘤的突变谱都不一样，每
个肿瘤在不同阶段的突变谱不一样，每个肿瘤在同一阶段不同位置subclones突变
谱也不一样。肿瘤演化是divergent和branched的，如何找到属于特定时间和空间上的
某个肿瘤的真正元凶？在时空上你得知道下一阶段哪些个subclones会dominate。
2.很难说肿瘤的生长是否真正依赖于特定些个mutations。 Oncogene additive现象仅
仅发现于很少数的oncogene上。肿瘤很可能不会真正依赖于某个或某些个driving
mutations上。
3.即使找到了真正的driving/maintaining mutations,它们一定是可以druggable吗？
很多靶点根本不具有druggability。
4.耐药性往往是致命的问题。你还得通过Next Gen Seq建立耐药谱？！
5.肿瘤不单纯是基因病。Epigenetics是重要的因素，microenviroment也是重要的cell
non-aut... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 9 >ESC是一个动态变化的cell
population（或者说其heterogeneity非常大），即使subcloning以后，一个cell pool
里，各个细胞之间差别可能比我们想象的要大———无论是transcriptome水平，还是
epigenetic水平——但这一点，估计得靠singel cell analysis来验证的。
Sure
plus Monte Carlo Markov Chain Stochastic approch
pls refer
Hanna J et al. (2009)
Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration.
Nature. 462: 595-601.
link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19898493
or
Max Flöttmann et al. (2012)
A Stochastic Model of Epigenetic Dynamics in Somatic Cell R... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 10 博后就得会subclone吗
没搞过subclone的即将毕业的博士飘过。。。 |
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c****j
发帖数: 258 | 11 哈哈，当年我当博后时连莫尔浓度都不记得了，subcloning也没觉得难，虽然解决过一
个一年没做成的subcloning，不过从我做蛋白表达的过程理解，还是会有一些有难度的
实验不是follow protocol就能解决的，虽然解决了也发不了什么文章。 |
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发帖数: 1 | 12 说你是学艺术史的你别不服。
设计一个杆状病毒，可以穿黏膜，进血液不是什么难的事情。几百刀做几个PCR
subcloning，就完事了。 |
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k*****e
发帖数: 22013 | 13 【 以下文字转载自 Queer 俱乐部 】
发信人: university1 (guagua), 信区: Queer
标 题: Generation of viable male and female mice from two fathers
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jul 18 00:29:26 2011, 美东)
Biol Reprod. 2011 Mar;84(3):613-8. Epub 2010 Dec 8.
Generation of viable male and female mice from two fathers.
Deng JM, Satoh K, Wang H, Chang H, Zhang Z, Stewart MD, Cooney AJ, Behringer
RR.
SourceDepartment of Genetics, The University of Texas M.D. Anderson Cancer
Center, 1515 Holcombe Blvd., Houston, TX 77030, USA.
Abstract
... 阅读全帖 |
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m****s
发帖数: 18160 | 14 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: niceboat (Spore), 信区: Biology
标 题: Open Position: Research Scientist – Metabolic Engineering & Fermentation
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 15 16:01:59 2013, 美东)
Job ID: GF2013A003
Posting Title: Research Scientist – Metabolic Engineering & Fermentation
Brief Introduction of Gate Fuels Inc.: “Imagination, Innovation,
Implementation --- Enabled Technologies for a Green, Clean World”
Gate Fuels, Inc. is a biotechnology startup company that is developing
recombinant Bacillus s... 阅读全帖 |
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b***1
发帖数: 7 | 15 We are looking for an experienced research associate to join a team working
on stem cell and other technology development.
The successful candidate will have a strong background in mammalian cell
culture (ES cell experience is desirable), as well as extensive experience
in standard molecular biology techniques, including manipulation of plasmid
(vector construction, subcloning, site-directed mutagenesis), transfection,
Western Blot Southern Blot, Northern Blot, Immunofluorescence. Experience
wit |
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m****s
发帖数: 18160 | 16 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: niceboat (Spore), 信区: Biology
标 题: Open Position: Research Scientist – Metabolic Engineering & Fermentation
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 15 16:01:59 2013, 美东)
Job ID: GF2013A003
Posting Title: Research Scientist – Metabolic Engineering & Fermentation
Brief Introduction of Gate Fuels Inc.: “Imagination, Innovation,
Implementation --- Enabled Technologies for a Green, Clean World”
Gate Fuels, Inc. is a biotechnology startup company that is developing
recombinant Bacillus s... 阅读全帖 |
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d********f
发帖数: 43471 | 17 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: Peasant61 (老农61), 信区: Biology
标 题: 薄厚们， 再见！
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Nov 26 17:33:04 2012, 美东)
有人知道俺是谁。 不怕。 照说不误。 不过这恐怕是最后一次了。 因为该说的都说
了。 评语也不看了。 无非骂俺变态而已。 俺就特变态， 怎么？ 犯法吗？
比如， 你做个简单的subcloning， 一个薄厚能搞上3 -4 星期， 还不见得搞成。当中
还要你不断的trouble shooting. 因为某些人会做一些莫名其妙的事把本来很简单的
事变得很复杂： 比如用的根本就不是那个酶， 但然后他告诉你就是那个酶。 除非你
时时刻刻看着他， 不然打死你也想不到;这种薄厚还常常声称自己超时工作，没日没夜
。 有
的还骂你是吸血鬼。 还不知道到底谁吸谁的血哪。 自己搞， 每天顺带2 小时， 有3
-4 天就成了。 总共加起来也就一， 二天时间。不比帮薄厚trouble shooting时间多
哪去。 交给公司搞， 200-300 刀，2 星期 搞定。中间... 阅读全帖 |
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r***a
发帖数: 14 | 18 Then count me as the fifth. :)
Your problem reminds me one problem I had before. I kind
of did the similar things, PCR a short piece, about 140 bp.
After I subcloned it into TA-vector and
the sequencing, I found the gene was in the vector except
the restriction sites. Weird. Currently my labmate is having
the same problem, the restriction sites on the ends of
primers are not there although all other sequences seem
fine. Her piece is about 120 bp. Is it related with the PCR
of small pieces? B |
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M****e
发帖数: 70 | 19 with my experience, the suggestion is to check the PCR product
first. i would rather not digest the PCR product, actually, it
is better if you can subclone it first. for double digest with
NheI and XhoI, if you are using NEB buffer, use buffer2. digest
the insert and vector for enough time, and make sure your enzymes
are good (i think so from your description). unless the cloned
gene is harmful to the bacteria host, the cloning problem often
come from incomplete digest for such cloning strategy. |
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c*******o
发帖数: 8869 | 20 digestion of PCR product can be very tricky, what i do is following:
1 purify your PCR product with qiagen kit
2 use T4 PNK phosphorylate your PCR product's blunt end
3 ligate your blunt PCR fragment into any vector cutted with blunt end enzyme
(like EcoRV)
4 transformation and mini prep plasmid
5 then use hindIII and EcoRI cut the fragment out of vector
6 purify your hindIII-EcoRI fragment with kit and insert it into the vector
you want to use
this will add one more subcloning step but i am sur |
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n****e
发帖数: 1677 | 21 no kidding, ppl here still enjoy talking about overnihg western, old
subcloning with restriction digestion and ligation... |
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r***e
发帖数: 2539 | 22 我想绝大多数情况下hetero足够了，但我做过一个primary cell culture subclone，大
多数细胞是-/-,但的确发现一些是flox/-，就是说切了一个allele，应该和cre promot
er的强度有关。 |
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g*****n
发帖数: 241 | 23 我从ATCC买回一个质粒，打算PCR之后subclone到我的载体，但那个基因的5’端从ATG
开始的40个碱基只有三个A/T，GC含量是97%，但整个基因的总GC含量正常。我只好把正
向引物设计在质粒上，最后三个碱基和ATG重合。
我用了phusion polymerase的HF buffer，没有带。换了它的GC buffer，试了不同的退
火温度，结果要么是很多带，要么没有。
请问大家有没有什么建议？
谢谢！ |
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Z******5
发帖数: 435 | 24 试一试touch down。 此外，做subclone可以考虑使用酶切。有时候不一定有直接的位
点可以使用，尝试一下有没有同尾酶或者用酶切之后补平等手段，总会有解决办法的。
ATG |
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b******n
发帖数: 4225 | 25 subcloning一段区域然后转到别的载体上操作
突变好之后再cloning back
sometimes the most stupid way is the most efficient way
HF |
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s**********e
发帖数: 2888 | 26 领域里面一个比较牛校的实验室，很多年的工作都是基于一个他们实验室才有的cell
line，他们没有描述这个cell line是怎么来的，只是一句话很笼统地说是从ATCC的细
胞subclone来的，引用文献是最早ATCC的那个细胞的文献。
我搜索了一下他们用的细胞的名字，所有的文献都是他们实验室的。给PI写了一封信，
问能否把cell寄给我。
但是我还是觉得，这样的工作，有什么意义？那个细胞又没有什么经济价值，到底是啥
不清不楚，发这种别人都没有办法重复的文章，有什么意义？ |
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s****9
发帖数: 932 | 28 我前段时间也是有个简单的subclone做不出来，后来实验的technican上手２天就搞顶
了。
后来发现别人给我的viral vector本身就不对。
汗，我已经postdoc第二年了。
80bp |
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s***o
发帖数: 1189 | 29 谢谢大家，和测序中心几个人交流后，
得到一个比较合理的解释：
酶切会影响得率，对非high copy的plasmid影响尤其严重。
而gel回收在融胶时候，会有DNA的变性和复性，有的序列可能形成不规则结构比如三链。
估计要把insert subclone到比如 T-easy里面了。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 30 HPDE6 and its subclones might be a choice. |
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w*******d
发帖数: 396 | 31 Just my personal opinions for your reference. Maybe I am wrong.
1. If it is up to me, I will subclone the longest fragment and fuse it to
the upstream of a reporter gene, then mutate the three respective ATG to see
if there is any difference. Ususlly, the first ATG is dominant in
transcription.
2. Is it possible that your GSP acutally recognize a sequence in the reverse
orientation and there is a transcript generated in the reverse orientation?
There maybe duplicated sequence in genome. |
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s********r
发帖数: 312 | 32 有chimera就mate吧，出不来germline再重新打。。有空就做做subclone和karyotyping |
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j****x
发帖数: 1704 | 33 跨平台的商业软件，简单一点的如DNAMAN（老牌），复杂一些的如CLC Bio Workbench
（强力），都是不错的选择，免费的有Serial Cloner（DNA序列分析和subcloning利器
），DAMBE （北美中国教授出品，推荐）。
Linux下开源的软件包就更多了（emboss等），看你的具体需要了 |
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l********t
发帖数: 2 | 34 pcdna3.1 v5-his和PCAGGS-GFP磷酸钙共转染原代神经细胞，然后染色GFP和V5tag，GFP
信号很强，但是V5信号非常弱，表达很低。但是HEK上共转染，GFP和V5都很强。是因为
PCDNA的promoter在神经细胞里不太好使吗？考虑要不要subclone到pcaggs载体里去。 |
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z*t
发帖数: 863 | 35 单酶切条件下insert磷酸化+vector去磷酸化能把自连降到多少？
现在想把一个cDNA subclone into another vector,但目的vector只有两个酶BamHI和
MluI可以切，并且BamHI还会在cDNA内部有一个切点。。。除了单酶切，我还有什么办
法么？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 36 hehe，没错，太不划算了
genescript这样的苦力公司，一个最最简单的subcloning还要差不多200刀呢 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 37 就是提供目标片段，construct，他们负责作subcloning然后miniprep寄回来这种，或
者直接给序列合成出来寄回来也行？用过地说说好用么？
在想是不是以后把分子克隆全部出去作。。也省了一堆仪器试剂的钱了 |
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S*********s
发帖数: 304 | 39 祖国人民用genescript
3.2rmb/bp,有condon opt,做subcloning
感觉还不错
老实说，还是RT便宜 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 40 多谢楼上几位的信息哈 请问你们用的主要是合成还是subcloning？ |
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b******s
发帖数: 1089 | 41 I tried to amply 2XGFP by one PCR and subclone it into some vectors. The
template contains two tandem GFPs but PCR can produce only one 700bp band.
The 1.4K band is very weak and smeared. Before redesigning long gateway
primers to include a little flanking regions, I want to see if anybody have
trick for such PCR? Thanks a lot! |
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k*******s
发帖数: 214 | 42 无论pyrosequencing 还是NGS，得到的数据都是整个基因组的信息，不是你想要的rDNA
序列。很浪费。
一个可行的办法，就是用PCR，直接PCR全长的rDNA,模板是样品直接提取的gDNA (粪便
样品），然后做subcloning，就可以分析。可能要测很多序列，比如几万个。优点是序
列干净，可靠，全长 |
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a****d
发帖数: 1919 | 43 Two step PCR should work for your propose.
synthesize two pair of primers:
F1-xxxx
30bp-xxxx-R1
F2-xxx-30bp
xxxx-R2
PCR separately, then put together both products as template, PCR again using
F1-xxxx and xxx-R2. The final PCR product could be subcloned into the
plasmid. You have to find the suitable digestion sites when designing
primers though. |
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s********r
发帖数: 312 | 44 Checked with the technician. We use "Subcloning Efficiency DH5α Competent
Cells" from invitrogen. I think TOP10 and DH5α are similar, except the
former having better efficiency.
" |
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z*h
发帖数: 773 | 45 try this new technology -- Simple Cloning.
You, C., X.-Z. Zhang, and Y.-H. P. Zhang. 2012. Simple Cloning: direct
transformation of PCR product (DNA multimer) to Escherichia coli and
Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol.:doi:10.1128/AEM.07105-07111.
Abstract
We developed a general restriction enzyme-free and ligase-free method for
subcloning up to three DNA fragments into any location of a plasmid. The DNA
multimer generated by prolonged overlap extension PCR was directly
transformed in E... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 46 RE:
俺也参合一把
if GC rich >3kbp
first choice:
htp://www.clontech.com/FR/Products/PCR_RT-PCR_Real-Time_qPCR?sitex=10020:
22372:US#
htp://www.clontech.com/NO/Products/PCR_RT-PCR_Real-Time_qPCR/Long_PCR_and_GC
-Rich_PCR/Advantage_GC_2_DNA_Polymerase?sitex=10023:22372:US
then subcloning. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 47 是吗?
下一步不做啦
ensure efficient recombination in host cell
需要的吧?
please refer:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC155262/
Forty-base-pair overlaps are adequate to ensure efficient recombination in yeast (Hua et al. 1997;
Oldenberg et al. 1997). Hence, we considered it likely that 80-bp recombination linkers, with 40 bp of
vector overlap and 40 bp of fragment overlap, would be adequate to stimulate efficient fragment subcloning |
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s********r
发帖数: 312 | 48 佩服楼主的精神，但这篇文章让我读的悲从中来。WB应该算是生物实验中倒数第二简单
直白的了，倒数第一的是常规的subclone。
当时我在国内读硕士的时候也是一样，什么试剂都没有，自己配buffer，洗玻璃板，配
胶，那破玻璃板还漏，一上午有时候都配不好一块胶，用那种几百块钱的破抗体，买来
之后马上分装好，每个人分那么一丁点，自己的用完了要到处看人脸色借，自己配显影
液定影液，有时候要在暗室里等半个多小时才能看到条带。cloning也是一样，稍微稀
有点的酶都要去隔壁借个几微升回来，感受态细胞自己做，PCR也是连个kit都没有，提
质粒自己配buffer。
楼上有些人说的对，试剂钱是省不下来的。我整个硕士都在纠结这些trouble shooting
，各种做不出来跑不出来，老板指着鼻子说你们这些人分子生物学都是弱智。后来拿到
master赶紧跑路来美国读PhD,前几个月做这些都有心理阴影,洗膜曝光的时候都神经兮
兮的，生怕做不出来。结果WB和cloning怎么做怎么有，慢慢的才对自己恢复了信心。
现在看的那些细胞分子方面的paper，western都是一堆一堆的，cloning更是直接带... 阅读全帖 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 49 自己配miniprep，这还是俺十几年前干的呢。
不过mini prep kit花不了多少钱
subcloning, 如果挑六个克隆，没有一个对的，那就应该换strategy了。 |
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