L*****t
发帖数: 56 | 1 最近准备纯化一个2,500kDa的大蛋白复合体，压箱底的一根superose 6柱子试了一下已
经老得没办法用了。新的预装柱自然买不起，问题是单买这个胶也很贵。Google搜到了
Toyopearl HW-65，分离范围和superose 6差不多但是价格只有五分之一。不知道这个
胶有没有战友用过？分辨率如何？ |
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r****o
发帖数: 105 | 2 本文献给YL
（十五）AP1的活性测定
第二个模块的实验，DNA affinity chromatography之后我们又跑了一个更精细的
Gel filtration，用的是Amersham卖的Superose 6预装柱子。纯化步骤就只有这么多了。
剩下的就是一些活性测定。无论是sephacryl分出来的组分还是DNA affinity column分出
来的组分，我们都测试了AP-1的活性。方法呢就只有两种，一种是凝胶迁移率变动分析
(EMSA)，另一种是DNA水解酶I 足迹分析 (DNase I footprinting assay)，都可以用来分析
蛋白与特定DNA的结合能力。我过去没做过这两种实验，所以感觉很新奇，做的也格外卖
力，结果也还不错。
Gel Mobility-shift assay 原理很简单，把蛋白质样品和P32标记的寡聚核苷酸探针
一起孵育十几分钟, 然后拿去跑一个低浓度acrylamide胶。如果探针结合上蛋白了，速度
会变慢很多，就会停滞在胶的上段；如果没有结合上，探针就会自由的跑到胶的下段去。
然后把胶拿去做放射自显影就行了。跑胶的装置 |
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a****k
发帖数: 1130 | 3 你不是有抗体的吗，gel filtration之后做western就好了啊。最近帮别人做了一些这
方面的实验，是可行的。550Kda在superose 6还有superdex 200上都是不会从void
position出来的，monomer和tetramer肯定是可以分开的 |
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a****k
发帖数: 1130 | 4 superose 6上面650KDa的standard蛋白和void还是有相当的距离的。不知道你当时用的
是什么gel filtration column？还有，load的sample volume，elute的speed也会有影响 |
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s********n
发帖数: 2939 | 6 看起来你的buffer没有问题，但是Superose 6的分离范围是5-5000 kDa，可能很难分清
100 kDa和60 kDa的区别。就像楼上说的，可能60 kDa的蛋白是多聚体，而100 kDa和25
kDa有比较强的相互作用吧。
跑个native gel看看吧。 |
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d****h
发帖数: 21 | 7 你的蛋白是细胞还是细菌表达的？如果是E.coli里的话，这个60kd很可能是hsp60 本身
就是多聚体，出峰的位置和void volume一致。我不知道superose 6的void是多少，如
果符合的话可以确认是60kd是多聚体。25kd也可能是你的100kd降解了一小部分？ |
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s*********t
发帖数: 600 | 8 用100ul的上样环可以吗？不能再少了吧？
最多能上样多少体积？用1ml的上样环可以吗？
谢谢指教！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 9 只要你乐意，上多少都可以。但是峰会变胖
一般而言我从来不上超过200ul的样
但是蛋白本来就很纯的时候也有500ul 的。反正就是出来一个胖峰。 |
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s*********t
发帖数: 600 | 10 那跟上样环有关系吗？能用1ml的上样环上200ul样品吗？
我手头只有100ul和1ml两个上样环 |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 哦！原来你是这个意思啊！
那没有问题，就是注入的时候要小心产生泡泡
另外，如果你不明白我的意思的话，我的意思是上样环里不应该是空的，
而是一开始就应该在洗完之后注射进满满的缓冲液，所以反正你本来
就不是对一个空的上样环来注射的。明白我的意思了吧？ |
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s*********t
发帖数: 600 | 12 好像明白。上样环都是先用buffer洗过的，里面充满buffer的。
就是说随便往上样环里面注入多少样品，只要不超过柱体积和上样环的体积，都是可以
的，对吧？
比如，如果是100ul的上样环，注入200ul样品就不行了吧？反过来，1ml的，可以随便
上样1ml以下的样品，对吧？
周末了，实验室一个人也没有，只有我在苦逼的过柱子，找不到人请教 。。。
谢谢sunnyday老师指点！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 13 对的，因为假如是100ul的上样环，注入200ul样品的话就会有100流到废液
里面去了。所以在你的情况下只好用1ml的环了。
有的人会采用先注射100ul，上得差不多之后停止走柱再来100ul，
但是这种方法很不好掌握，我强烈不建议。
最后，一般原则是注入体积尽可能要和环的大小接近，比方说如果你只有50ul
的话，如果用1ml的环，在注入过程中就会由于液面的扰动而被稀释。 |
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s*********t
发帖数: 600 | 14 明白了！ sunnyday老师真是好人啊！！！ |
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a****k
发帖数: 1130 | 15 完全没看懂。。。
你是要纯化某一个蛋白？什么叫不稳定，容易被降解？什么叫总聚集在一起。。每个
fraction都跑胶了吗？蛋白多大，特性，用的superose 6还是superdex 200还是什么？ |
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