e****p
发帖数: 354 | 1 做3’RACE 快半年了，用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
)，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
一般用什么办法或强大的酶。。。
非常感谢 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 2 可以，我扩过，12kb
对细菌基因组的质量要求比较高
我是自己提的
跑胶没有smear，条带>46kb (single cut lambda DNA as marker)
然后用的TAKARA的LA PCR kit （Long&Accurate）
一次成功
就是筛没有error的克隆费了点劲 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 3 筛选没有技巧
就是不停地送出去测序呗
然后片段比较大你肯定要设计不少sequencing primer才能保证都覆盖到
就是先送出去一批只从两端测
正确的克隆再送出去进行下一批测序
这是省钱费时间的做法
要是你老板不care
你就一股脑儿都送出去咯，所有的sequencing primer一起测
呵呵
我记得TAKARA的LA里面是Taq和另外某个带proof reading的DNA polymerase的混合
Taq保证扩增速度，另外一个减少出错率
但是混合的比例好像有讲究
以前看过原始的文献
但是一时半会儿找不到了
也记不清楚了，不想误导你 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 5 同顶这个
不过23kb还是有点长
我用这个takara的p过12kb |
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b******r
发帖数: 111 | 6 Anyone has experience of inserting 9kb in a 8.4kb vector? 2 months was gone
,but I get nothing. Would
you like to take a look a this protocol and give me some suggestion ?
Thanks a lot
Purpose: Insert 9kb mouse sequence into vector pPNT6.
Vector pPNT6: Its map is at http://www.addgene.org/pgvec1?
f=c&identifier=11072&atqx=pnt6&cmd=findpl . I have inserted 0.9kb DNA in
this vector at XhoI/EcorI
double sites. I should have no problem in cloning short fragment.
Insert DNA is 9kb.I have cloned t... 阅读全帖 |
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f*******e
发帖数: 354 | 8 买了个signosis的single cell real time PCR kit, 但是你面的东东实在太少了，做一
次预实验就消耗了不少，不知道大家有没有用另外的DNA polymerase, 不至于有CDNA但
是没有聚合酶做PCR啊
看了takara的 LA taq， EX taq，都是用来扩增长片段的，没有提到可以用于扩增非常
少的cDNA。
谁做过的推荐下，非常感谢！ |
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j*********o
发帖数: 237 | 9 要扩一个5K左右的片段，做鉴定用，不用很精确，能扩出来就行，有没有比较推荐的
taq酶啊？以前在国内一直用takara的La-taq，不知道有没有更好的？ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 10 5 kb不长
随便扩扩基本上都能出来啦
当然模板特别难扩那是例外
Takara的LA-Taq是好，不过拿来扩5kb的实在有点大材小用
我用它扩>10kb的 |
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M****m
发帖数: 2142 | 11 takara HS taq？我们3kb的用普通酶也没有问题，是不是你ｐｒｉｍｅｒ不好？ |
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Z******5
发帖数: 435 | 12 扩高GC的片段，我一直都是Takara的 primerstar 和 LA-taq/GC Buffer 1 一起做，哪
个能扩出来用哪个。
这个很难说，虽然GC含量都很高，但是有些片段用primerstar扩的很好，有些用 LA-
taq/GC Buffer 1 扩的很好。
总之为了节省时间，多试几个酶，几个温度梯度。 |
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j*********o
发帖数: 237 | 13 takara的la-taq不错，但20kb还是够呛，我们以前实验室的极限是12kb |
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n********k
发帖数: 2818 | 14 谢谢你的详细意见。首先要说，我做分子克隆的经验不是很多。其次，基本不会不改变
条件反复重复。
1 当初选用pQE8也是没有办法，因为pQE9我们实验室没有（pQE8和9的区别就是8在酶切
位点之间只有一个碱基，而9要长得多）。最开始的时候没有意识如此近的酶切位点很
难切下来，最起码同时酶切不可能切下来。但是只尝试过一次顺序酶切不行就没有再尝
试用pQE8了，我不记得是先切BamH1还是Hind3，后面尝试插一段片段在2个酶切位点之
间再切。
Nice alternative, shall solve the problem in this case...but I would just do
blunt ligation, nowadays, the fast ligation kits from different companies
such as Roche, takara, don't really care about whether it is sticky or blunt
ends, it works just as well...BTW, any one else ... 阅读全帖 |
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f**u
发帖数: 346 | 15 呵呵，看来英雄很多时候还是会被人看出身。
华大是测序出身的，但是现在已经不仅仅是做测序了，可以说他们是在做基因组学。
基因组学像你说的有很多部分，测序是第一步，现在更重要的是分析测序的结果。
再往后面还有功能基因组的一大堆东西。
华大在数据分析这一方面还是很下功夫的，很多工具是自己开发的。
那个熊猫基因组是第一个用next gen完全鸟枪测出来的哺乳动物基因组，
是用他们自己开发的软件给组装起来的，这个在生物信息学领域是个挺了不起的成就。
他们现在也开始在做功能方面的东西，总之和基因组沾边的方向他们都在做，
而且全世界来比较好象也都还做得不错。
他们唯一没在做的就是没有开发新的测序技术，
当然这个可能也是版上大多数技术出身的朋友一说起华大就有些不屑的原因。
其实作为一家事实上的公司，华大不一定要通过技术上领先来成为成功的公司。
比如日本的那个Takara，最近十年做得很不错，但是很难说他们技术有多优秀。
作为服务性质的公司，可以通过很多途径来占领市场。
其实放眼望去，在每个领域，技术领头羊都只是那么几个，但都风光无限，
实际上大部分的公司都是服务性质的，这些公司可能占据了很大的市场份额... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 17 1.可能没有全长cDNA
2.可能有全长cDNA，但是用的DNA polymerase没办法从你的模板里p 9kb
解决方法可以有
1.如果对cDNA质量有怀疑，重新制备
2.换DNA polymerase，我用过TAKARA的LA DNA polymerase，不过模板不是cDNA，是细
菌gDNA，
扩了13kb。模板是细菌gDNA还是人/老鼠 gDNA还是cDNA还有区别的，可以参考他们网站
3.既然小段的可以P出来，就重新设计引物，分两段或者分三段甚至四段扩，（互相
overlap)分别扩
好了以后再做mega PCR |
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r***e
发帖数: 2539 | 18 要不试试takara的Extaq或者LAtaq？
pfx效率是比较低。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 19 Takara的Hotprime的酶很好使，就是突变稍微比pfu高点 |
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a*******u
发帖数: 2 | 20 请问PCR扩增8kb的一个基因是什么难度？
还是说没有普遍性？因基因而异？
我们实验室想以人或小鼠的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师觉得一次扩增
这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其中片段都不成
功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢？ |
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a*******u
发帖数: 2 | 21 请问以cDNA为模板扩增8kb的一个基因是什么难度？（该基因分子量接近300kd）
还是说没有普遍性？因基因而异？
我们实验室想以人的细胞系或小鼠组织的cDNA为模板，扩增一个大约8kb的基因，导师
觉得一次扩增这么长的片段不太可能成功。确实，我们试了分段P，结果P 4000bp的其
中片段都不成功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗？我们用了oligo和random引物，takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元，比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢？ |
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M********r
发帖数: 23 | 22 我做过3kb的，效率比2kb以下的要下降很多....
建议用takara的LA taq+GC rich buffer （I orII），这个高保真酶会自己加A的，所
以省一步效果很不错的。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 24 If one uses takara PS enzyme, switch from a ramp rate 20c/ sec to 2.2c/sec,
using a same protocol the chance for a failure is very high...if your
protocol was not robust, any change could just ruin it...It depends on so
many different factors... the ramp rate could matter a lot or nothing...only
yourself would know/figure why...the key is to know your system and know-
how...don't always wait to know a tech in depth until one runs into troubles
...many of those painful/costly failures could be a... 阅读全帖 |
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a******c
发帖数: 597 | 25 Takara PrimeStar polymerase. |
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a******c
发帖数: 597 | 26 Takara, prime star polymerase. |
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Z******5
发帖数: 435 | 27 建议后面PCR多试几种不同公司，不同特点的酶。比如我当时就是用Takara的
Primerstar和GC Buffer的LA Taq。有时候，其中某些酶扩增很烂或者没有，而另一些
酶-Buffer就很好。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 28 模版是什么？
cDNA？
细菌gDNA?
人／老鼠gDNA?
用过takara的LA(long and accurate)
扩～12kb，细菌gDNA
然后TOPO blunt end
测序，20个里面拿到一个全长都正确的
不过这是几年前
现在不知道哪一家long amplification做得最好
虽然每家都说自己的最好LOL |
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s********n
发帖数: 2939 | 29 只是猜测：你这种情况可能像ls有人提到的，形成A-B active complex比较复杂，或者
不稳定，易形成aggregation。可以试试，
1）in vitro reconstitution, 用很低的浓度做试验（ug/ml）；A和B在高盐浓度下的
稳定性如何？如果稳定的话，你可以试试在高盐（1 M even higher）条件下做混合，
高盐可能可以降低non-specific interaction形成aggregation的几率；
2）in vivo，你可以试试用weak promoters表达你的蛋白（Aw+Bw, Aw+Bm, Am+Bw; w,
weak, m, medium），lower temperature，coexpress chaparones。
不过个人更倾向于试in vitro的方法，in vivo的local concentration太高了即使在
low expression的条件下。
BTW: Chaperone的plasmid可以买Takara (Clontech)和Agilent (Stratagene). |
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C*******e
发帖数: 4348 | 30 谢谢
我其实上周刚刚试了Takara家的一套5个chaperon plasmids
很可惜
因为用chaperon plasmid不能用codon plus或者rossetta strain
A蛋白完全没有表达
（WB探测不到；以前已经知道A有好几对tandem、甚至triple rare codon，需要codon
plus才能overexpression）
所以现在需要codon optimized ORF才行
还会继续试的
我想问问，如果说in vitro, low concentration试验的话
用什么手段检测/定性复合物呢
, |
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i*****g
发帖数: 11893 | 31 takara 是提供全套试剂，类似 shopping mall， supermarket
这个要起始投资几个亿。否则即使看见几十个亿在前面，也是吃不到。
国内很多都是小散户，最终还是被老外吃掉。
办法是，借助风投，筹个几亿的钱。问题又来了，技术人股份多少？
还有，人家根本没有兴趣做这个，随便去北京上海买10套房，不就是安稳投资么。
人家去贿赂官员，搞块地皮炒炒，3年后转手2-3倍卖出，干嘛要搞这种苦哈哈的实业啊？ |
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i*****g
发帖数: 11893 | 32 没什么用。那些小企业，等欧美一个大企业，supermarket模式的，一过来，全部碾死。
就好像上面的解释过了，takara的很快就消灭了那些小家伙，人家大而全的产品系列，
价格还可以，质量不错。 |
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a****d
发帖数: 1919 | 33 I have been using primestar from takara. It works great so far. |
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s******y
发帖数: 17729 | 34 黄到没有黄，但是作为老牌，被博雅这种拼爹的可以说爆出渣了，其实当时最早的应该
是鬼子的takara，不管是测序，还是山寨kit，可以说又快又好，便宜量大。迎合买不起
/等不起一线kit的土砖窑主。这些年早就日薄西山了吧。 |
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y******m
发帖数: 143 | 36 应该是TAKARA，一家生物公司，在这就职应该比去做博士后强吧！！！ |
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m****a
发帖数: 270 | 37 Takara，Takeda和Takata 三个公司，去哪个比较油钱途？ |
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C****n
发帖数: 79 | 38 最近要将一个 3k+1k+2k的片段分别克隆到一个3k和8k 的载体上。试了两周Infusion
clone (Clontech, TAKARA）没弄出来。 Trouble-shooting过， 也用过overlap PCR
先assemble两个片段。但是仍然得到的是阴性结果（基于Colony-PCR和Restriction
enzyme digestion）。
之前一直用Infusion clone，虽然效率有高有低，但是这次彻底挂了。
理论上说Infusion比Gibson要效率高。当然其他方法如Golden Gate cloning， 还有
yeast recombination也许能行。不过似乎都有点麻烦。
请问各位大虾，对于我的这种情况，有没有其他类似高效快速的方法，或者克隆效率低
的可能性是什么呢？
不甚感谢。 |
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发帖数: 1 | 39 我一直用Clontech In-fusion，曾经一次将三个GFP tandem链接到一个10kb载体，一次
成功。In-fusion效率几乎100%，以至于我现在克隆所有片段都是用Phusion PCR出来，
In-fusion后挑一个菌落抽质粒直接测序。
用Infusion的时候最重要的两点是overlapping区域一定要是15bp，另外就是insertion
和vector的比例。如果你是克隆到8kb载体中，其他3kb,1kb,2kb与8kb的molar ratio应
该为1：1：1：0.5。你可以用clontech的infusion MOLAR ratio calculator。可惜的
是clontech被TaKaRa买了，网站变得奇差。你可以自己算。8kb vector以为200ng为准
，那么3kb是150ng，1kb是50ng，2kb是100ng。建议所有片段PCR，然后跑胶纯化，
nanodrop测浓度。如果浓度不高，那么可以整体scale down，但是ratio一定要是1：1
：1：0.5。
等有了8kb这个克隆，你就可以直接PCR中间3kb-1kb-2kb，然后... 阅读全帖 |
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