c******r
发帖数: 3778 | 1 sybr green也可以，但是需要分开跑。
sybr green是个non-specific的DNA double strain dye.就是说，只要是PCR产物都可
以stain。所以没法用multiplex reation做internal control。
如果用taqman，pcr效率不错的话，可以设计两对primers，一对测你的target
sequence，一对做个其他随便什么基因的sequence。分别用不同的颜色标记。这样在一
个样品里跑两个pcr。如果如果target sequence是control的50%（一般给+-20%的误差
）就是single copy。如果和control一样（也是20%误差）就是two copies。
如果你的primers设计比较好，两对的amplification efficiency非常接近，那么可以
直接用ct数来计算二者的关系。但是如果两对primers的效率相差比较多，那么只能每
次都分别给两个primer做standard curve。这样保证二者的定量可比，也是可以的。就
是麻烦点。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 2 是，实际上target specific的primer可以run两三对都没问题。
qPCR为啥不能用multiple target specific primers？只要label不同颜色就可以啊？
SYBR当然是不行的，但是TaqMan是可以的哈 |
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a******s
发帖数: 37 | 3 taqman low density array, affymatrix, exiqon LNA array 哪个更可靠？ |
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l******u
发帖数: 936 | 4 of course "taqman low density array"
但是分析数据要注意, 不能用他们的内参. |
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h*******o
发帖数: 4884 | 6 最近作了一些Taqman的Low Density Array (LDA), 老板要cluster analysis
Array 小白，只会用data analysis assist那个软件, 里面有2个 选项，
一个是Pearson's Correlation 一个是 Euclidean Distance。
哪位大侠能深入浅出的给讲讲，有什么区别？
如果我相比较组间gene expression区别有多大，是不是用Euclidean Distance 比较好？
谢谢！ |
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n*****r
发帖数: 78 | 7 做Taqman realtime RT-PCR时间很长了，一直没问题，最近NTC和RT-突然出现扩增，CT
都在35左右。通过大量的NTC，RT-和RNA extraction negative control重复测试，初
步判断为随机污染。做了所有我能想到的，换成新的试剂，引物，探针，用UV或bleach
洗泡桌面，枪，盘子....等等，还是没解决问题。
哪位大侠有经验，帮我一把。谢谢。 |
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D******9
发帖数: 2665 | 8 我想看一下几个microRNA在human cancer cell line和primany cell的表达，, 不知
道用那个INTERNAL CONTROL，a&b网上的对照太多了。 谢谢 |
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Z******5
发帖数: 435 | 9 "在同一个pcr中，同时run两个甚至两个targets，其中一个是control，另外一个是要
测的基因"
这个用TaqMan貌似是可以，但是我们一般只用SYBR GREEN，一管中不能同时跑两个反应
的。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 10 double check了，位置没load错
实验室的qPCR仪一直用来做taqman，很多年没人用过SYBR green了，我觉得可能是
detector坏掉了
还有别的啥可能么 |
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e*****t
发帖数: 642 | 11 it's hard to answer your question if you don't provide details.
how many snps you are going to genotype? are u using array for genome wide
or taqman for a few snps? |
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p*******r
发帖数: 59 | 12 Career Opportunities at JCVI Infectious Disease (8 Positions)
The PIs did not ask me to post here, I did this just in case someone is
looking for similar positions but did not see these, and I would be happy to
see some chinese fellows to come. All the PIs are very nice.
All listed at
https://careers.jcvi.org/careers/Careers.aspx
http://www.jcvi.org/
No. 1 & No. 2 Post-Doctoral Fellows
Job Responsibilities
JCVI is looking for two Post-Doctoral Fellows to join the Infectious Disease
Group in our ... 阅读全帖 |
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y*****h
发帖数: 166 | 13 Position level – Research Associate III or Senior Research Associate –
will be determined based on candidate’s background and experience.
Responsibilities and Duties
Responsible for the set up and performance of both in vitro and in vivo
experiments. The candidate will set up and perform in vitro experiments
using purified primary cells from human blood or mouse tissue. The candidate
will be involved in complex in vitro experiments requiring high technical
skills and precise planning. Addition... 阅读全帖 |
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n**8
发帖数: 221 | 14 用过affimetrix，挑了10个candidate 做taqman-Q-PCR 确认，结果没有一个能被
confirmed。。。 |
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c******e
发帖数: 350 | 16 Sorry for no Chinese input at work.
I had some real-time PCR run with TaqMan probe. A false positive result was
showed for an actual negative sample. When I checked its amplification curve
(green line in figure below), I found it's different from other samples.
The signal intensity never goes up as a real amplification curve (of even a
negative sample). However, because the change of the intensity from baseline
occurred earlier, the Ct was calculated as lower than other negative
samples, and the... 阅读全帖 |
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c******e
发帖数: 350 | 17 Thanks a lot! 但是TaqMan probe不是不会测到primer dimer么？
The Ct for the green curve samples got at 38. In another experiment a
negative sample gave a Ct at 36.
These 2 occurred very rarely (2/50). When I repeated it, 1/4 chance gave
negative result. |
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R****n
发帖数: 708 | 18 I am trying to quantify the miRNA by taqman miRNA assay. There is a miR-574
that I am interested in. But invitrogen only make hsa-miR-574-3p. the
sequence seems different. Should I order this one? |
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a******p
发帖数: 414 | 19 1. abi miRNA profile based on Taqman PCR, 一个sample 大约 5000，dollar， 你
有<10个samples的话，10K肯定够了，好处是 它measure mature form of miRNA
2.microarray, available in affymetryix , exiqon ect, it should be 1K/
samples, 有很多假阳性，但总能找到一些
3.exiqon SYBR based miRNA RT PCR, ask the company directly，
4.a lab in our university developed a microarray chip and it is very cheap
but the quality is just so so |
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H*******g
发帖数: 321 | 20 这个是sequenom的网站上关于genotyping的介绍。这个方法最多可以把40个SNP
multiplex在一个pool里面，对于你们要做的这种genotyping比较适用。Illumina也有
低通量的genotyping的array，你也可以试试看。Taqman也有genotyping的assay。一般
他么的网站上都会介绍。具体要看你们那里的core facility喜欢用哪种了。 |
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T******y
发帖数: 14506 | 21 taqman assay
$200-300/probe, 1 probe for >1000 people.
contact ABI company
包子 please |
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X***n
发帖数: 366 | 22
TaqMan microRNA qPCR array: single cell level. |
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s******s
发帖数: 13035 | 23 补充一下，我说的是living cells里面的，不是taqman那种realtime probe |
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L******e
发帖数: 679 | 24 Using TaqMan SNP genotyping assay to detect a SNP. The problem is that all
samples (blood genomic DNA) always showed the same "heterozygous" patten:
signals for WT and SNP are the same.
Does that mean the probes bind unspecifically? i tried different annealing
tep. at 60, 62 and 64 C degree, looks no much change.
The Tm of the primers: 55 C (forward) and 59 C (reverse)
The Tm of probes: 51 C (WT), 49 C (SNP)
PCR product: 90 bps
The primers and probes are designed by the ABI.
What can i do nex... 阅读全帖 |
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n*****n
发帖数: 202 | 25 Pharmaceutical company in North NJ. Temp position available. prefer
candidates with experience in cell based assays, molecular cloning, taqman
assay,DNA/RNA isolation.
H1b visa can be sponsored.
If you are interested, please email me.
Thanks. |
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C******d
发帖数: 362 | 26 刚做real-time PCR，遇见了一个大问题，待高手解答，先谢谢了！
我的样品没有扩增曲线，但gel显示band is there.
PCR 反应溶液组分：
DNA 2 uL, 50-150 ng， 260/280 都在1.8-2.1之间
taqman probe: 2 pmol
primers: 4 pmol
master mix: 10 ul
总共： 20 uL
real-time PCR 仪器是：Stratagene Mx3000
昨天和合成probe的公司联系，说可能要加DMSO，今天就加了5%，结果同样是没有扩增
曲线？
primer和probe，都是按文献设计做的。莫非是仪器设置的问题？还是其他莫名原因？
跪谢！！！！ |
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h*******o
发帖数: 4884 | 27 Taqman probe is fluorescent with a quencher. |
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v***2
发帖数: 131 | 28 which type of fluorescence for Taqman probe? Fam? Vicor? cy5...
and what is your setting in machine? which step do you collect data?
More possible,it is your real time PCR instrument setting problem |
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C*******e
发帖数: 4348 | 30 没用过Taqman probe
不过光看你的曲线
第二个图里明显是baseline substraction那步有问题
没用过你的机子不熟悉
至少在bio-rad家的机子里是可以选择是哪几个cycles的平均值做baseline的
默认好像是2-8
可以改成2-7，2-6，2-5，再少好像就不行了，
但可以直接输入一个值作为baseline的矫正
不同机子处理大同小异
一般情况下这样取baseline没什么问题
因为很少那么早循环就起来的
但是你的standard template信号比较强（拷贝数比较多）
挺早曲线就抬起来了
再用default的方法做baseline什么的就会产生你图上的结果
就好象是倒下来的S一样的
其实就是因为前几轮里面信号已经不能被当成baseline值处理
更不能拿来做矫正
建议就是一个可以看看能不能调看哪几个cycle作为baseline调整的依据的
或者可不可以手动给一个值
如果说下次还要做这样的实验，建议稀释standard template，
根据你上面的结果，把它稀释到跟sample比较接近的区间
这样就算用default处理也不会有问题了 |
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a*******o
发帖数: 16 | 31 最近用Taqman MGB probe做realtime也遇到问题，产物跑gel没问题，但是
amplification的曲线就是不对~ |
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a*****g
发帖数: 543 | 32 RT-negative 值太高；
很像是你的plasmid contaminate.否则要靠genomic DNA达到你的Ctvalue挺难的 （当然
你的primer应该intron spanning...最好是TaqMan based method)
建议换水（买水， 买新的primer-probe mix),借别的lab的枪, 用filter tips...
sample |
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m****e
发帖数: 489 | 33 J Microbiol Methods. 2003 Jan;52(1):123-31.
Application of the fluorogenic probe technique (TaqMan PCR) to the detection
of Enterococcus spp. and Escherichia coli in water samples.
Please send to a********[email protected]. Thanks! |
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n*******9
发帖数: 234 | 34 应该说，楼主的意见原则上是正确的，博后甚至博士的训练应该以idea为主，但现在绝
大部分的薄后也就是个technician水平， 甚至许多PI都没什么idea， 不少博士后甚至
连taqman,sybgreen qPCR的原理都不清楚，probe 和引物也都是直接从公司定购以下，
否则生物这一行就不是现在这种状况了
生物实验数据可靠，我认为最好方法就是外包，包括western 这类，由公司专门来作，
减少选择性失明 |
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m****e
发帖数: 489 | 35 Biotechnol Lett. 2012 Apr;34(4):627-33. Epub 2011 Dec 9.
PolyA RT-PCR-based quantification of microRNA by using universal TaqMan
probe.
Luo X, Zhang J, Wang H, Du Y, Yang L, Zheng F, Ma D.
Can you pls send to a********[email protected]? MANY THANKS!! |
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s*****7
发帖数: 96 | 36 求助本版的大侠和高手一个问题。小弟我最近遇到一个问题。我设计了一组primer 和
probe 用于TaqMan QPCR. 在RDP上可以查到每一个primer 或者probe的coverage 在我
所要扩增的种属里面。但是，我现在想知道要是我用一套set（two primers and one
probe)在这个种群里的coverage. 这个可能牵涉到miltiple probe overage的问题。
哪位高手以前要是做过这方面的工作，能否指点一下，多谢。 |
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n*******t
发帖数: 58 | 37 寻找有Bioinformatics和编程经验的同学，编写软件，有报酬。该软件是根据DNA序列
来设计qPCR的引物和探针（非TaqMan）。有兴趣的，请联系： s*******[email protected]
谢谢。 |
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j*****q
发帖数: 82 | 38 plasimd DNA和genomic DNA都是用水溶解的。
后来又试了taqman的probe和primer，还是一样。但是另一个项目就work的，很奇怪啊
。继续求助！ |
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X***n
发帖数: 366 | 39 TaqMan® Allelic Discrimination assay |
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m****M
发帖数: 360 | 40 你这信息量太少，你这模板是稀释的质粒，DNA片段还是你总样品的混合样品呢？是
TAQMAN还是SYBRGREEN？是怎么稀释的，１０X还是５X？ 以我将近近１０年的QPCR经验
看，你这后面几个稀释就没有扩增出东西。看样子是SYBRGREEN？你这起始浓度太高，
都４个CYCYLE就出来信号啦。 |
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s*****3
发帖数: 20 | 41 Here are my 2 cents.
1) If you only look at one or a few SNP(s) for that gene, Taqman SNP
analysis (in 384-well or even in 96-well format) can be your choice. This is
much
cheaper and faster than Sanger or NGS.
2) If you look at 10-100 SNPs, Openarray SNP analysis (using OpenArray or
Quantstudio) can be your choice.
3) If you look at a large number of SNPs, e.g >100 SNPS (though I doubt it
since you only look at one gene), you could consider NGS target resequencing
such as Ion Torrent custom Am... 阅读全帖 |
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h********n
发帖数: 4079 | 42 设计一些taqman probe + primer |
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C*******e
发帖数: 4348 | 43 limit应该是PCR Efficiency of certain primer pair
我以前做absolute quantification的时候，standard curve的dynamic range是10^6到
10^2
standard curve出来很好，从Ct值上判断再多一个1/10 dilution也是可以的
PCR Efficiency能够到1.8、1.9的话，测50个拷贝应该不是什么问题
但是现在大多数做qPCR的实验根本就不去测每对primer pair的PCR Efficiency |
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s******9
发帖数: 283 | 44 When you deal with less than 100 copies, you need to consider RT-PCR as a
series of random processes (e.g., Poisson): 1) template destruction, which
is significant for RNA templates, 2) distribution of successful cDNA
synthesis, and 3) distribution of successful cDNA amplification in each
cycle. Many stochastic variations can affect a final output. |
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a******a
发帖数: 283 | 45 Thanks for the input.
Chamgrape, we might be using different system, the way how we calculate and
express the PCR efficiency is by %. Mine's usually between 90-100% (good
range is 80% - 110%). What kind of samples you are using for "no problem
with 50 copies/well?". Are you using pure sample or you have to harvest the
samples with a matrix system (such as carrier RNA etc).
synbio79, i was wondering how much it can help to optimize the RT experiment
before doing qPCR. Have you done so? |
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C*******e
发帖数: 4348 | 46 我不知道这个80%-110%是怎么计算的
Bio-Rad有些好像是这样显示PCR Efficiency的
我说的就是自己做曲线，用质粒，因为浓度、大小（分子量）已知，然后推导
如果你说的80%-110%跟Bio-Rad家的一样，那么是还可以啦。
我说的case是cDNA，我没有做过carrier RNA
and
the
experiment |
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h****u
发帖数: 618 | 47 需要买一台PCR 做 mRNA 和 microRNA expression. 以前一直都用 Applied biosystem
StepOnePlus™ PCR, 但是最近看到 Bio-Rad CFX96™ 不需要calibration
,但是StepOnePlus™ 是需要买calibration kit的。不知道哪个更好用呢？如果
两者性能相当，买 biorad 就一劳永逸了。
而且听sales 说， biorad 使用5个led 激发， steponeplus 只有一个蓝色led， 所以
做Multiplexing的话，是不是biorad 更好呢？
另外在 biorad 上使用 taqman 的试剂会不会有问题呢？
请大家指教。非常感谢！ |
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s******r
发帖数: 1245 | 48 Taqman有测SNP的real time assay
或者pcr片段直接去测序 |
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g********6
发帖数: 86 | 49 Lifetech TaqMan MicroRNA Assays |
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a******a
发帖数: 283 | 50 我做了一些，水解细胞，溶液直接加入pcr系统去。结果发现出现的都是假阳性信号。
当然我是读取taqman荧光信号来衡量pcr结果的，不是跑胶。
解释是，nucleases直接切掉probe上的fluorophores，所以出现的荧光信号都是假阳性。
那么对我来说，我这个系统（依靠读取荧光信号来判断pcr结果的）就最好先加tris
buffer和proteanse K来除掉nucleases，再水煮一下样品灭火protease K或者其他的酶
。之后加入PCR系统。
看看怎么样，这个方案可好？ |
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