发帖数: 1 | 1 恰好我刚刚看了，有篇日本实验室的文章解释了，HaCaT是极化的，其NTCP恰好在基底
膜上。把HaCaT用trypsin消化的同时感染，就能感染上了。很有意思。 |
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发帖数: 1 | 3 谢谢
比较好奇，
1.你说的“吹”就是直接在96孔板里用pipette“吹打”吗？
2.等于说直接“吹”就等于代替了trypsin的功能？细胞可以直接detached from
culture dish？
3. 不知道你的这个建议是针对sh-sy5y，还是所有细胞的crispr?
many thanks！ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 4 只用他们的medium和trypsin-EDTA.
reserve |
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s*********y
发帖数: 292 | 5 嗯，让大家去配个没有EDTA的trypsin去试试
说实话，我不觉得这跟做不做的出来有啥关系…… |
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m****a
发帖数: 270 | 6 常用的 0.25% Trypsin with 1 mM EDTA
DMEM里含 2.4mM CaCl2, 0.8mM MgSO4, 干掉残存的那一丁点EDTA绰绰有余。
莫非alternatively那句话暗藏玄机？做不出来的赶紧去给培养基加点儿Mg试试。。。 |
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G***G
发帖数: 16778 | 8 I have set the maximal missed cleavage as 0.
The second R are not cut site at all. |
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m*******n
发帖数: 1214 | 9 1/ you have to dilute down your urea
2/ avidin beads is not that easy for trypsin to digest.it is on solid beads,
even a little was digested, so what? the Mass can still detect them as long
as your sample don't containing avidin, so it is kinda irrelevent |
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y***l
发帖数: 1095 | 10 我现在需要design一节实验课，是给高年级本科生major的，三小时长左右的主要用
MALDI-TOF。我们有ULTRAFLEXIII MALDI-TOF一台，但我其实对MS懂的不多，只是附带
着管一下MS，以前的MS经验也不多。我能想到的也就是给个PROTEIN,让学生用TRYPSIN
DIGEST，然后测PEPTIDES，然后做DATABASE SEARCH。但是觉得这个太普通了，就想知
道大家有没有新颖一点，好玩一点的IDEA，有详细步骤更好了，因为偶比较外行的说。
谢谢！ |
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b*******g
发帖数: 1309 | 11 protein digestion 3 个小时完成不了
复杂一点的proteomics 实验都要一两天吧。。。
有个建议，你们这个仪器能做TOF/TOF吧，
比较一下proteomics ID 用 PMF 跟 MS/MS search database的区别
一人两个蛋白，一个已知，一个未知，第三个 两个蛋白混在一起
已知的看准确度，未知的看ID 对不对
TRYPSIN |
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e*****e
发帖数: 12 | 12 难怪美国本科教育差, 这种实验都是不懂的人去准备.
TRYPSIN |
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s*****d
发帖数: 110 | 13 小弟最近在做个实验， 希望能有尽量高的peptide mapping coverage， 但是有几个
peptide做了几遍都看不见， 有什么方法或者调什么parameter可以把它搞出来啊？
我用的是trypsin digestion， dionex 3000+ LTQ
希望大家帮帮忙啊 多谢！！
update: 是个recombinant peptide (117 amino acids) |
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b*****y
发帖数: 175 | 14 Thanks a lot for all your responses.
I did just inject the sample directly (highly acidic) and I did not have a
good spectra at all. The reason I am doing basic pH was based on our
previous experience and the recommended column conditions. Also I always
perform intact protein analysis and tryptic digestion peptide analysis
together. Trypsin works best at pH7-8 so I always try to use ammonium
bicarbonate to achieve this pH and have minimum salt after lyophilization.
I highly suspect vitamin C con... 阅读全帖 |
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b*****y
发帖数: 175 | 15 Thanks again for all your new inputs!
Additional information:
1. I used Vydac MS C18 capillary column.
2. The sequence coverage of my protein (from trypsin digested peptides MS
analysis) is consistent (80%) for both non-treated and treated samples. So
my confusion is since the protein identity is confirmed from peptide MS
analysis, why it does not show in protein MS analysis.
3. We do not have MALDI in the lab so it is hard to check using another MS
technique.
4. I found out the 28498 Da peak in... 阅读全帖 |
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f****n
发帖数: 95 | 16 我在为含氟的丙烯酸酯/丙烯酰胺类高分子寻找good solvent,发现trifluoroacetic
acid (TFA)的溶解能力特别强，很好用。可是，高分子（白色粉末）溶解于新鲜的TFA
之后溶液由无色透明慢慢变为淡黄色透明。
是不是因为TFA是强酸有所谓的发烟现象？浓盐酸就是淡黄色，因为含有少量杂质Cl2
。另外， 含卤素或含硝基的化合物容易变颜色,是少量变质导致的吗？
谢谢！
p.s.
查到有这么一句：“olutions of proteins in trifluoroacetic acid prepared in
vacuo
are clear and colourless; on exposure to air, a purple colour develops.”不
解中···
Nature 174, 509 (11 September 1954); doi:10.1038/174509a0
Anhydrous Trifluoroacetic Acid as a Solvent for Proteins
JOSEPH J. KATZ
Chemistry Di... 阅读全帖 |
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s*****d
发帖数: 110 | 17 小弟最近在做个实验， 希望能有尽量高的peptide mapping coverage， 但是有几个
peptide做了几遍都看不见， 有什么方法或者调什么parameter可以把它搞出来啊？
我用的是trypsin digestion， dionex 3000+ LTQ
希望大家帮帮忙啊 多谢！！ |
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s*****d
发帖数: 110 | 18
Hi,
Thank you for your reply!
What I am doing is just pure digestion, add protein and trypsin then dilute
a little with Tris. I did not add any extra chemical into the reaction. What
is more, when I search online, I also include some possible modifications.
So I think the modification is not a big issue.
I just wondering how to adjust the digest condition? could you plese give me
some clues? thanks |
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K******S
发帖数: 10109 | 19 It's hard to give you suggestions without knowing the exact sequence of
those peptides. (K/R position, size, hydrophobicity etc assuming you use c18 column)
Did you do reduction/alkylation before digestion?
What's your trypsin/protein ratio? |
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m*********3
发帖数: 1425 | 20 新手，刚开始学习mab的分析，感觉这个版面上做mab的很多，有几个简单的基础问题请
教，
1.我用了trypsin和pepsin digestion,但是peptide coverage还是只有80%左右，N-
terminal尤其是CDR没有检测出来，大家一般还用什么其他的酶？比如chymotrypsin,还
是AspN好一些？
2.另外关于检查PTM（oxidation,deamidation, glycosylation)的software方面，现在
分析数据都是送给offsite的地方，等结果要好几天，也学不到什么，想自己也独立分
析分析，大家知道什么open source或者free dowload的软件推荐吗？先谢谢了。 |
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f*********e
发帖数: 1144 | 21 for pure mAb in formulation buffer, the coverage should be > 95% with
trypsin digestion, nearly 100% for CDR, some dipeptides may elute very early
and can not be detected,
increase your LC time by making a shallower gradient may help
also make sure your mass accuracy is within spec |
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m*********3
发帖数: 1425 | 22 新手，刚开始学习mab的分析，感觉这个版面上做mab的很多，有几个简单的基础问题请
教，
1.我用了trypsin和pepsin digestion,但是peptide coverage还是只有80%左右，N-
terminal尤其是CDR没有检测出来，大家一般还用什么其他的酶？比如chymotrypsin,还
是AspN好一些？
2.另外关于检查PTM（oxidation,deamidation, glycosylation)的software方面，现在
分析数据都是送给offsite的地方，等结果要好几天，也学不到什么，想自己也独立分
析分析，大家知道什么open source或者free dowload的软件推荐吗？先谢谢了。 |
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f*********e
发帖数: 1144 | 23 for pure mAb in formulation buffer, the coverage should be > 95% with
trypsin digestion, nearly 100% for CDR, some dipeptides may elute very early
and can not be detected,
increase your LC time by making a shallower gradient may help
also make sure your mass accuracy is within spec |
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w*****s
发帖数: 230 | 24 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: wwwjobs (minimouse), 信区: Biology
标 题: 请看看附件图片文字，建议我们能做什么呢？
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Jan 16 12:24:03 2014, 美东)
附件是主治大夫的reasoning(email回复，红字)， 他的水平我们还是很佩服的，因为
他已开始猜了个病就和我们宝宝症状非常一致，可惜后来发现不是；而且他不是代谢病
专家。
问题是坚持宝宝不吃长链脂肪酸的奶粉后，他奇迹般地改善了；完全出乎医生们的预料
。我感觉医生列的是常见的代谢病，而我们感觉宝宝吃长链脂肪酸似乎是慢性中毒，大
概需要一个月左右才能体现出来。因为过程很慢，我们怀疑很多方法查不出来。
我们最大的问题是如果是这种病怎么查？不能确认的话他一辈子吃饭都受影响，基本也
就很难出门时间长一点了。尤其是他的肝已经在要换的边缘。医生们现在改口说他的病
程都是偶然，可我们不能同意。为什么每次都是长链吃一段时间就得病，尤其是这次停
了鸡蛋后马上改善。。
谢谢大家。 （下面是文字，可惜设置不成红色）
Q: Our big... 阅读全帖 |
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