u**********d
发帖数: 573 | 1 效率怎么样？处理后再轻轻吹打能不能把组织或培养的细胞克隆打散成单细胞？
对细胞的伤害大不大？跟用trypsin比呢？
看millipore的介绍，可能这个溶液里的主要成分是一种受专利保护的EDTA，这种EDTA
不能进入细胞去影响胞内蛋白的功能了吗？
用过的请来说说。 |
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l********s
发帖数: 70 | 2 我们可以讨论，这两天在做CHIP，你买 Cell singalling 的beads，我觉得挺好用。里
面把bsa什么的都是ready to use
另外我建议，用1mm glass beads 在计入125mM glycine 以后，打晕组织再次，打个6
次，中间休息1-2min 放在冰上。 trypsine 可以不用。 我这里些个protocol 可以给
你，07年nature protocol 有个 fast chip 你就可以借鉴
qq 53671616 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 3 RE:
孵蛋的学第/妹 giantbird05 (大鸟)
Did you use Claycomb-medium ?
if not, please use it
Claycomb-medium (Sigma, Germany)
plus fibronectin/gelatine-precoated cell culture flasks.
more details about stuff protocol
pls go to
PLoS One. 2012; 7(2): e31669.
PuMeb link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3285183/
citation:
>Cell culture
>The HL-1 cardiomyocytes (murine atrial tumor cell line) were
maintained in monolayer culture with Claycomb-medium (Sigma,
Germany), supplemented with 10% fetal calf serum... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 4 注意media Lot的原产国
最重要的一个 可能是
去甲肾上腺素
1% norepinephrine (Sigma-
Aldrich, Germany)
from
北美的有的牛来源的原料
其中的疯牛病因子 and 瘦肉精因子等比德国的EU标准高
以下的所有东西 订货 按原产国来 订货 then try again.
Cell culture
>The HL-1 cardiomyocytes (murine atrial tumor cell line) were
maintained in monolayer culture with Claycomb-medium (Sigma,
Germany), supplemented with 10% fetal calf serum (SAFCBiosciences,
USA), 1% penicillin/streptomycin, 1% glutamax
(both Invitrogen, Germany) and 1% norepinephrine (Sigma-
Aldrich, Germany) in an incubato... 阅读全帖 |
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h******y
发帖数: 351 | 5 如果你的MEF是用作feeder的话，不建议用超过6代的细胞。
MEF对ROS很敏感，传代过多，MEF会自发immortalization。
分MEF最简单的办法是把组织挤过18-20G的针头，然后trypsin 3-5 分钟。MEF的培养液
中不需要加b-ME.
了。 |
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h******y
发帖数: 351 | 6 In your case, I think you might want to try different protocol. A good
protocol should yield nice MEF culture from the wildtype embryo at least.
The most important thing is to avoid overdigestion with trypsin, which will
always leads to poor culture.
[发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com] |
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m*****z
发帖数: 1451 | 7 取embryo，去头和内脏，剪碎，0.25% trypsin 37oC消化10分钟，seed在10cm盘，3-4
天传代
一直这么做没问题，不过从来没有handle过比较神奇的MEF就是了。 |
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g****0
发帖数: 425 | 8 我都是把组织泡在Trypsin-0.53mM EDTA四度过夜，然后37度消化，一个embryo可以张3
-6盘10cm板，有何不妥吗？ |
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y****6
发帖数: 196 | 9 I need to digest an antibody into small fragments. Which protease is the
best? Trypsin?
Thanks a lot |
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T****u
发帖数: 424 | 10 看来你真是外行。
当我们听说NTCP的时候，it makes so much sense.
正如前几天juzbox在帖子提到的他的同事发现以前他们的一个小分子是作用在NTCP上一
样。在临床上，牛黄熊去氧胆酸胶囊一直被一些临床医生用于乙肝治疗及防止复发。牛
黄熊去氧胆酸正是NTCP天然的ligand.这些作为chemical genetics的data可以进一步来
support NTCP.
你提到另外的一些问题几乎都不是问题，
If 你听过Wenhui的talk
当你发现一个PI never hide negative data的时候，你知道他的data是可信的。
or
If你知道NIBS core facility中有一个玩质谱如神一样的人物-陈涉的话，你就不会对
任何NIBS文章的proteomics data提出质疑了。
If你知道Wenhui的太太是做什么research的话，你也许也不会再有这些疑问了。
你就可以想见他应该还有其他一些什么reagents或data.
你认为NTCP is the most strong band, then they showed it.
... 阅读全帖 |
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f*********6
发帖数: 94 | 11 You are the most welcome.
I only used the ERK inhibitor, and that was several years ago. The inhibitor
did improve the derivation efficiency. Having the p38 inhibitor in the
medium might help. You may also want to be sure that LIF is working well,
and i think this is very important.
The most tricky part to me is the patience. If you don't see any colony at
the first a few days, don't give up and just wait for a few more days.
Meanwhile set up more crossing in case that batch does not work, and t... 阅读全帖 |
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h*****G
发帖数: 113 | 12 小弟不才，最近需要从培养的beta细胞提取全部胰岛素，测胰岛素的总含量。看了很多
paper，都是用ethanol/HCl溶液提取，但是具体过程都语焉不详。有的是从组织中提取
，把组织放在ethanol/ HCl中研磨，然后离心取上清。现在我是培养皿的细胞，也需要
用trypsin把细胞detach，然后放buffer里homogenize吗？还是直接把buffer加到培养
孔了，然后取上清就可以了？希望有经验的达人不吝指教，如果有详细的protocol就更
好了。
小弟先谢了。 |
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p*****p
发帖数: 19331 | 13 in vivo labeling不麻烦，而且很便宜
关键是你实验室要有license,用磷32，能够看整体磷酸化水平。
phos-tag我接触过，光跑胶难度就不小，厂家的protocal都在变化。最后能达到的最理
想效果就是接近in vivo labeling的能力。
in vivo label之后，sample可以做磷酸化氨基酸分析，你就能知道是哪一种氨基酸磷
酸化了。然后可以用trypsin消化label的样品，做2D mapping......不过这一套做下来
也很费工夫。
搞research就是很费工夫。没有办法，光想没有用。
你还是先要免费抗体好了，要到几个是几个。打电话给这些公司，准备好fedex帐户，
大多数公司会免费送你一点，足够你做几次western的，但是肯定不会free shipping给
你。 |
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a******n
发帖数: 392 | 14 因为人胚胎干细胞解离成单细胞后会分化或者死亡，所以一般细胞传代时是不用
trypsin的。这时人和鼠干细胞不同的地方。 |
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p*****h
发帖数: 36 | 15 Foci - cells piled up, with no contact inhibition.
It is likely that you had clumps of cells after trypsin digestion, and these
clumps kept growing. |
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s******y
发帖数: 28562 | 16 是不是长成了一个小岛状？如果是的话，说明有一定的contact inhibition,
用trypsin短暂处理，把细胞团打散就好了。 |
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k******y
发帖数: 236 | 17 在贴壁细胞中siRNA了某基因，之后就有大量的碎片漂浮在medium里，镜下看就是小圆
泡，diameter < 10um，而细胞即使trypsin消化下来之后也并不是规则的圆形，这些碎
片并不能uptake trypan blue，计数活细胞(trypan blue-, diameter > 10um) 的数量
有明显减少, 但以trypan blue+ 的％算，并不比对照组减少很多，大概从95％减少到
90％
用FITC-Annexin V和PI double staining，做flow没有看到明显Annexin V+细胞群，
AnnexinV+ PI+细胞群会增加但也不会增加太多(本身％也小于10％)
用50uM Z-VAD-FMK caspase inhibitor 与siRNA共同处理细胞, 这些碎片就不会产生，
计数活细胞的数量也不会减少, 和对照细胞没有差别
请问这是否说明细胞有死亡？能否看出是何种死亡方式？谢谢大家! |
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D***e
发帖数: 44 | 18 本来我想这就是个小实验，检测细胞的吞噬作用。实验设想是，我用一种荧光颗粒，孵
育细胞不同时间和经过不同处理后，看哪种条件下细胞吞进去的多。细胞是贴壁生长的
，荧光孵育后我用Trypsin处理，冲洗多次，以确保没有会影响结果的荧光颗粒残留，
再去上Flow Cytometry。
以前没接触过Flow Cytometry。今天去了core facility，结果对方直接否定了我的方
案，说不够精确，要用更复杂的，又要染细胞膜，又要染细胞核，还要用indicator区
分到底是胞内还是胞外的，还要一个一个titration试。
我深深钦佩对方工作认真负责的态度，今天我也长了很多知识，理解到Flow Cytometry
是一门博大可深刻挖掘的技术。但无奈老板push，要求我这篇文章在一个月内投出去，
实在不行就去掉Flow Cytometry的部分。但我觉得有了还是加分的。
想听听大家的看法？ |
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p******b
发帖数: 379 | 19 我个人的经验是， 不同的细胞表达GFP的快慢也不一样， 同样的病毒同时感染两种不
同的细胞， 有的细胞出GFP的时候快， 有的细胞慢， 比如MM231 GFP在感染十几个小
时之后就非常明显了， 然而有些细胞48小时才明显
同样的病毒用相同的滴度感染不同的细胞， 感染效率也不一样。
可能跟细胞的病毒受体多少有关， 病毒进入不同细胞的快慢和多少不一样
当然同样是lenti， 不同promoter， 感染的快慢和效率也不一样
感染的方法可能也有点影响， 江湖传说reverse infection（感染当天trypsin细胞，
同时把细胞，病毒和HB一起加到培养皿）比普通的先铺好细胞第二天感染效率高一点点
， |
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z****u
发帖数: 1007 | 20 换一下酶。我个人感觉collagenase不够强。组织解离不够。 我用collagenase 2mg/ml
+dispase. 或者直接上trypsin LE 都可以。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 21 现在在用HUVEC细胞做实验，这细胞长得很慢，但是我做实验需要很多细胞，更重要的
是这个细胞只能用2-4代做实验，传的代数多了以后至少形态上就变化了。
1) 冻村的细胞可否看作passage 0？
2) 复苏到dish里开始培养的细胞看作 p1？
3) 每传一代，trypsin处理一次，代数增加 1？那么对于suspension 细胞怎么算第几
代？
4) 比如我把细胞养到第10代了，然后冻起来了，再复苏，算p0 还是p10？
5) 为了能用低代数细胞做实验，可不可以传代时候细胞密度适当低一点多分几个dish
，这样就有足够的低代数细胞做实验了？
问题可能比较菜，请大家帮我澄清这个问题。网上google的结果大家似乎说法都不一样。
谢谢了！ |
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w*****s
发帖数: 230 | 22 附件是主治大夫的reasoning(email回复，红字)， 他的水平我们还是很佩服的，因为
他已开始猜了个病就和我们宝宝症状非常一致，可惜后来发现不是；而且他不是代谢病
专家。
问题是坚持宝宝不吃长链脂肪酸的奶粉后，他奇迹般地改善了；完全出乎医生们的预料
。我感觉医生列的是常见的代谢病，而我们感觉宝宝吃长链脂肪酸似乎是慢性中毒，大
概需要一个月左右才能体现出来。因为过程很慢，我们怀疑很多方法查不出来。
我们最大的问题是如果是这种病怎么查？不能确认的话他一辈子吃饭都受影响，基本也
就很难出门时间长一点了。尤其是他的肝已经在要换的边缘。医生们现在改口说他的病
程都是偶然，可我们不能同意。为什么每次都是长链吃一段时间就得病，尤其是这次停
了鸡蛋后马上改善。。
谢谢大家。 （下面是文字，可惜设置不成红色）
Q: Our biggest concern is the reason of his liver damage.
A: The biopsy shows severe fibrotic changes and tells us that this is not a
liver that ... 阅读全帖 |
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a**********2
发帖数: 28 | 23 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
-3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
任何意见或建议都欢迎〜 多谢！ |
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m**********3
发帖数: 706 | 26 I dont use trypsin for 293. Just shake your flasks and they will be flushed
out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage. |
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d**********t
发帖数: 20415 | 27 这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
flushed |
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a**********2
发帖数: 28 | 28 用HEK293 adhesion cell两年了，一直很好。可从今年一月中旬起，开始出现突然死亡
的问题〜 头疼不已，爬到版上来求助
具体状况如下：我两年前拿到的细胞，培养后一次性冻到液氮里大概20管。每两个月
thaw一管，两个月内状态一直不错。今年一月中旬起，刚thaw时，在大概两周内(3-5次
passage)，细胞一直很正常。但在接下来的某一次trypsin之后，就会突然死掉，只有2
-3%的细胞attach到cell plate上，其它全部是悬浮状态。
我尝试了所有能想到的点：重新配了medium；去掉了所有的antibiotics；把cell
plate重新poly-lysine coating;请实验室的另一位同事培养我的细胞，用他自己重新
配的medium... 可细胞仍旧出现一样的状况。
版上有同仁遇到过相似问题么？没有细胞真是什么工作都无法开展〜
任何意见或建议都欢迎〜 多谢！ |
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m**********3
发帖数: 706 | 31 I dont use trypsin for 293. Just shake your flasks and they will be flushed
out. Then you can spin down and split them. This will reduce the damage. |
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d**********t
发帖数: 20415 | 32 这个293T吧，293感觉还是挺难晃下来的，lz这个应该和trypsin没啥关系
flushed |
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r******k
发帖数: 446 | 33 如果按着lipo2000说明书上写的 在90%左右 cell confluence的时候做transfection，
那第二天细胞就长的满满的了，这能行吗？ 是不是有contact inhibition？等细胞长
的很满了， 我可否trypsinize 然后转到更大的dish里面养？ |
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j****t
发帖数: 1663 | 34 我一般是70-80%confluence的时候做transfection，这个也要看什么样的细胞，有些细
胞分裂速度慢，多铺一些细胞应该也没有关系。
如果你已经用lipo2000做了transfection，我觉得第二天就trypsinize不太好。
建议你下次转一个带荧光的质粒，看看转染效率，这样你就知道铺多少细胞最好了。 |
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r*****m
发帖数: 3619 | 35 和老子这一代留欧的王大成，留学期间直接贡献了一些方法学，Robert Huber 在诺贝
尔奖得奖致辞上特别提了他的贡献。当然他是一个学生。所谓晶体指导药物设计，那时
就吹起来了。
In 1970, I had begun work on the basic pancreatic trypsin inhibitor which
has later become the model compound for the development of protein NMR,
molecular dynamics, and experimental folding studies in other laboratories.
Work in the field of proteolytic enzymes and their natural inhibitors has
been continued and extended to many different inhibitor classes, proteases,
their proenzymes, and complexes betwe... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 1584 | 36 两种Digestion没区别 要是担心Digestion 不完全多加点Trypsin就好了
膜蛋白我推荐In Gel |
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s*****o
发帖数: 2490 | 37 那篇trypsin消化的实验用的pH是9啊，人的小肠pH是多少？不到8吧？bt protoxin在pH
低于9的情况下是不溶的晶体状态，能被正确切割么？
另外你提到的bt toxin和人的cadherin受体的结合。我相信你说的有可能结合。但是关
键是potency啊，得多大的剂量才会结合？得多大的剂量才会导致你说的炎症反应？人
体的肠道有多大的可能会expose到这个剂量的active bt toxin？你要知道现在市面
上的几乎所有杀虫剂在人体都有specific target，比bt受体明确得多。如果你觉得bt
这种级别的风险都是不能接受的，那其他的杀虫剂你就更没法接受了吧？呵呵。所以说
你和我看问题的角度不一样，你考虑的是到底有没有这种风险，而我考虑的是这个风险
到底有多大。
把0 |
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A******y
发帖数: 2041 | 38 I'm curious what's the logic behind this? Trypsin left over or FBS left
over? |
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e****s
发帖数: 1125 | 39 搭车问专家个问题：
我想检测一个大约50kd蛋白Trypsin降解后的所有Peptides，直接跑MS，还是最好走LC-
MS/MS?
大概有40左右的片断，肽段大小都在200-4000 D。
刚做了一次试验，拿到些数据，正在琢磨怎么分析。 |
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w********3
发帖数: 39 | 40 你这个是很typical 的peptide mapping. 你去找个facility 都可以给你做，用
multiple enzyme digest,光用trypsin是不够的，还要Glu-c, Asp-N啥的。然后基本能
做到99-100%的recovery.当然你得有纯化的蛋白，大概需要10ug.还有质谱得是lc
coupled with orbitrap 或者qtof. FT-ICR应该不行，扫描速度太慢。
LC- |
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h********1
发帖数: 157 | 41 关键是要细胞在分裂期才会有一条条的染色体，否则就是染色质，哪能分得开呀。建议
细胞处于分裂活跃期的时候收细胞，不能太满。另外trypsin时间不要太长，收那些很
快就dissociate的细胞 |
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R****n
发帖数: 708 | 42 "细胞处于分裂活跃期的时候收细胞，不能太满"
20-30% confluence?
"另外trypsin时间不要太长，收那些很快就dissociate的细胞"
这个是什么原因啊？
谢谢 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 43 以前都是稀世后放平皿里养。待出单细胞克隆的细胞群后，用小的圆柱体和凡士林固定
后，trypsin下来，再养。
现在也这样吗？哪种小小的圆柱体和凡士林大家哪里购买呢？
好久不做附着细胞的单克隆了。。。
谢谢各位能给与指导。 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 44 1。在dish里铺很少细胞，长起来后在显微镜下面挑单克隆到96well里养
这得克隆长多大啊，还得肉眼厉害。。。。
2。稀释分散到96孔板
好主意，悬浮细胞我就这么做来着
3。FACS SORT 到96孔板
这得带标记啊。有时GFP啥的未必是好东东。
4。等克隆长大一点，用带大概20ul培养液的枪头搓几下，然后吸上来不就行了吗？
问题是一个平皿里有很多单克隆。如果这样就只能采一个克隆。否则细胞扩散，不就把其
他克隆的细胞搞混了么？
5。C1059 SIGMA sterile cloning cylinders with grease
这是我以前传统用的手法。
现显微镜小标记，然后用cylinders with grease（trypsin)选出来，再放在小dish里
扩增。。。
谢谢各位亲们的宝贵建议！！！ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 50 转化完后，我等一天，让细胞recovery.然后就上selection. G418用得比较多，你最好
在转化之前据测一个dose,看多少量能在7-10天杀死里的所有host cell. 太高太低都会
有问题。
看细胞生长速度。一般24小时divide一次的细胞，筛选一般要两三个礼拜。我习惯用
100 mm dish,一直加G418，到肉眼可以看到colonies,然后用20 ul的pipette,带消毒过
的tip，在显微镜下挑。
挑的过程如下：
100 mm dish用PBS洗两次，然后放10-12 ml PBS在dish里面。显微镜放进hood,放dish
的平台在hood门后面，保持消毒状态。把dish放上去，显微镜下找到colony,先把
pipette里的空气打出来，再用tip对准colony,轻轻撮一下，让细胞脱离dish,然后手指
一松，就把那团细胞吸进了tip。这20 ul的细胞带PBS放进96-well的平板里，加20 ul
trypsin, RT处理5-10分钟，加100 ul medium就可以转移到别的平板里了。看colony大
小，很多时候我就直接进24-we... 阅读全帖 |
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