t*****z
发帖数: 1598 | 1 如题，有些啰嗦，诸位好心的看官如果课题紧张的话，只看题目就行啦。
我在做一个最最常规的把插入序列连接到载体里面的分子克隆实验。插入片段两边的酶
切位点是BamHI和XbaI，载体当中的酶切位点是BglII和KpnI。其中BamHI和BglII是匹配
的，可以连接，但是XbaI和KpnI不匹配。但是我为了赶时间，打算强行连接了。我注意
到KpnI是平端。我想先把XbaI用Klenow片段修平了，再连接到KpnI的平端上去。我的具
体实验设计如下：
把插入序列和载体用T4连接酶连接一段时间（连接BglII和BamHI末端），然后把T4连接
酶加热失活，然后加入Klenow片段（他们的缓冲液相互兼容），反应一段时间（把XbaI
末端补平），加热失活，再加入T4连接酶，反应更长的时间（把两个平端相连），最后
转化。
这个方案不知可行否？成功率大不大呢？可以做什么样的改进呢？
另外我对T4连接酶的效率比较好奇。以前读书的时候，都是连接过夜，至不济也要连接
四个小时。可是现在的T4连接酶的说明书上，都只要五分钟十分钟的，是现在的酶果真
都那么强吗？各位平时做连接都连接多久呢？
谢谢各位！ |
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l******o
发帖数: 103 | 2 I have the following problem. I want to introduce a point mutation to my
plasmid. The plasmid is super big. So I first cut out a fragment(~4kb) with
XbaI and then ligate it to another vector. After introducing mutation with
mutagenesis kit, the sequencing result is as expected.
Next step is to put the XbaI-XbaI fragment containing the mutation back
into the original clone. After ligation and transformation with DH5alpha I
get a number of colonies (~20) but no colonies in the negative control. B... 阅读全帖 |
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p****p
发帖数: 3360 | 3 1. KpnI 不是bunt end。
2. 如果可能，先切KpnI和XbaI，klenow修平，再切BamHI和BglII。走胶切割纯化，连
接。
XbaI |
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h**********r
发帖数: 671 | 4 在此拜过克隆达人，跪求葵花宝典。
我正好有个克隆要做，就是teminator-promoter-ORF-terminator.
一看酶切位点设计的正好是：
pUC19 (HindIII)-(HindIII)terminator(PstI)- (PstI)promoter (XbaI)- (XbaI)ORF(
KpnI)-(KpnI)terminator(EcoRI)- pUC19 (EcoRI)
片段都不大。
请问葡萄MM，我这个能crazy一把吗？我做克隆也是身经百战了。
直接切PCR产物就OK了吧？
多谢！
实验成功，必有包子酬谢！ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 5 hoho，我这两天做的也是基于pUC19的
是pUC19(SacI)-(SacI)fragment I(XmaI)-(XmaI)fragment II(BamHI)-(BamHI)
fragment III(XbaI)-(XbaI)fragmentIV(HindIII)-pUC19(HindIII)
每个fragment大概0.8-1.1kb
然后我做的是pUC19 50 ng,
pUC19:f1:f2:f3:f4=1:5:5:5
总体积15-20 ul
ligate 20 hrs
然后3 ul加到一管TOP10电感化态细胞里
涂100-200 ul/平板
然后挑克隆
用colony digestion筛选
一起做了五个ligation
一天筛了近90个克隆
每个ligation都筛出正确的了
然后这些positive的提质粒出来
用不同的酶切再确认一下
然后测个序（或者不测）
直接PCR的切就行
不过我个人比较喜欢的是每个片段先做到TOPO里面（pBluntII)
先测序
挑序列正确的再酶切、胶纯化，往下做
这样每一步都是正确的序列
最后终产物酶切什么都对的话不测序也没关系
不然如果... 阅读全帖 |
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x******4
发帖数: 266 | 6 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: xbai1234 (xbai), 信区: Military
标 题: 未来已经到来– 量化和连结生活中的一切(转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jun 16 14:20:58 2014, 美东)
我还蛮常想像未来人类的生活型态会是什么样子，网路和行动装置的革命之后会是什么？
其中一个我觉得很有趣也开始成熟的是「量化自我」(Quantified Self)。这是一种用
各种感测器记录个人身体状态数据的「新运动」，从心跳、体温、血压、心理状态、每
天吃的食物、睡眠品质和时间、等等都把它量化并记录下来。这些数据非常有价值，除
了可以用来积极改善自己的健康和体能状态，在疾病发生时也可以提早有所警觉，甚至
回头追踪出致病的源头。
量化自我听起来很酷，现在也成熟到了有很多产品可以选择的程度。但如果再进一步来
看，量化自我的范围其实太小了，世界已经进展到了「量化生活」(Quantified Life)
。也就是一个人生活周遭的一切，不只是自己的身体，也包含自己所住的房子，开的车
，甚至走路经过的地方和路边的景色，都可以被量化... 阅读全帖 |
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x******4
发帖数: 266 | 7 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
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标 题: 未来已经到来– 量化和连结生活中的一切(转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jun 16 14:20:58 2014, 美东)
我还蛮常想像未来人类的生活型态会是什么样子，网路和行动装置的革命之后会是什么？
其中一个我觉得很有趣也开始成熟的是「量化自我」(Quantified Self)。这是一种用
各种感测器记录个人身体状态数据的「新运动」，从心跳、体温、血压、心理状态、每
天吃的食物、睡眠品质和时间、等等都把它量化并记录下来。这些数据非常有价值，除
了可以用来积极改善自己的健康和体能状态，在疾病发生时也可以提早有所警觉，甚至
回头追踪出致病的源头。
量化自我听起来很酷，现在也成熟到了有很多产品可以选择的程度。但如果再进一步来
看，量化自我的范围其实太小了，世界已经进展到了「量化生活」(Quantified Life)
。也就是一个人生活周遭的一切，不只是自己的身体，也包含自己所住的房子，开的车
，甚至走路经过的地方和路边的景色，都可以被量化... 阅读全帖 |
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x******4
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标 题: 未来已经到来– 量化和连结生活中的一切(转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jun 16 14:20:58 2014, 美东)
我还蛮常想像未来人类的生活型态会是什么样子，网路和行动装置的革命之后会是什么？
其中一个我觉得很有趣也开始成熟的是「量化自我」(Quantified Self)。这是一种用
各种感测器记录个人身体状态数据的「新运动」，从心跳、体温、血压、心理状态、每
天吃的食物、睡眠品质和时间、等等都把它量化并记录下来。这些数据非常有价值，除
了可以用来积极改善自己的健康和体能状态，在疾病发生时也可以提早有所警觉，甚至
回头追踪出致病的源头。
量化自我听起来很酷，现在也成熟到了有很多产品可以选择的程度。但如果再进一步来
看，量化自我的范围其实太小了，世界已经进展到了「量化生活」(Quantified Life)
。也就是一个人生活周遭的一切，不只是自己的身体，也包含自己所住的房子，开的车
，甚至走路经过的地方和路边的景色，都可以被量化... 阅读全帖 |
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x******4
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发信人: xbai1234 (xbai), 信区: Soccer
标 题: 未来已经到来– 量化和连结生活中的一切(转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jun 18 22:11:26 2014, 美东)
我还蛮常想像未来人类的生活型态会是什么样子，网路和行动装置的革命之后会是什么？
其中一个我觉得很有趣也开始成熟的是「量化自我」(Quantified Self)。这是一种用
各种感测器记录个人身体状态数据的「新运动」，从心跳、体温、血压、心理状态、每
天吃的食物、睡眠品质和时间、等等都把它量化并记录下来。这些数据非常有价值，除
了可以用来积极改善自己的健康和体能状态，在疾病发生时也可以提早有所警觉，甚至
回头追踪出致病的源头。
量化自我听起来很酷，现在也成熟到了有很多产品可以选择的程度。但如果再进一步来
看，量化自我的范围其实太小了，世界已经进展到了「量化生活」(Quantified Life)
。也就是一个人生活周遭的一切，不只是自己的身体，也包含自己所住的房子，开的车
，甚至走路经过的地方和路边的景色，都可以被量化、记录、... 阅读全帖 |
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x******4
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发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jun 16 14:20:58 2014, 美东)
我还蛮常想像未来人类的生活型态会是什么样子，网路和行动装置的革命之后会是什么？
其中一个我觉得很有趣也开始成熟的是「量化自我」(Quantified Self)。这是一种用
各种感测器记录个人身体状态数据的「新运动」，从心跳、体温、血压、心理状态、每
天吃的食物、睡眠品质和时间、等等都把它量化并记录下来。这些数据非常有价值，除
了可以用来积极改善自己的健康和体能状态，在疾病发生时也可以提早有所警觉，甚至
回头追踪出致病的源头。
量化自我听起来很酷，现在也成熟到了有很多产品可以选择的程度。但如果再进一步来
看，量化自我的范围其实太小了，世界已经进展到了「量化生活」(Quantified Life)
。也就是一个人生活周遭的一切，不只是自己的身体，也包含自己所住的房子，开的车
，甚至走路经过的地方和路边的景色，都可以被量化... 阅读全帖 |
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x******4
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我还蛮常想像未来人类的生活型态会是什么样子，网路和行动装置的革命之后会是什么？
其中一个我觉得很有趣也开始成熟的是「量化自我」(Quantified Self)。这是一种用
各种感测器记录个人身体状态数据的「新运动」，从心跳、体温、血压、心理状态、每
天吃的食物、睡眠品质和时间、等等都把它量化并记录下来。这些数据非常有价值，除
了可以用来积极改善自己的健康和体能状态，在疾病发生时也可以提早有所警觉，甚至
回头追踪出致病的源头。
量化自我听起来很酷，现在也成熟到了有很多产品可以选择的程度。但如果再进一步来
看，量化自我的范围其实太小了，世界已经进展到了「量化生活」(Quantified Life)
。也就是一个人生活周遭的一切，不只是自己的身体，也包含自己所住的房子，开的车
，甚至走路经过的地方和路边的景色，都可以被量化、记录、... 阅读全帖 |
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p*****n
发帖数: 981 | 13 ☆─────────────────────────────────────☆
sixtn (人在天地间如风中飞絮!!!) 于 (Mon Jan 29 00:24:15 2007) 提到:
最近，我在做一个双酶切的连接。最开始，在已经联入T simple vector的A段DNA序列
的一端有相隔四个碱基的两个酶切位点（XbaI和BamHI），然后用双酶切的方法把B段
DNA序列（两端带有相同的两个酶切位点）连进去。跑胶和回收都没有问题，大小也对
。但用T4酶或其它连接试剂盒连接后，再转化，总是长不出来。但其它同学用相同的试
剂做其它连接却能够轻而易举的长出来。已经做了三次了。对于原因百思不得其解，回
想实验过程是再简单不过，加液体这些也很难出错呀。化转也是很简单的步骤。不知道
哪里可能出问题了。
各位ggjj帮我分析一下可能原因好吗？多谢！
☆─────────────────────────────────────☆
goooo1111 (i!) 于 (Mon Jan 29 00:33:53 2007) 提到:
相隔四个碱基是不是少了一点？有些酶不切DNA尾巴， |
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t*********1
发帖数: 418 | 14 how many base pairs should be added at the end of a PCR primer after the
restriction enzyme recognition site to guarantee that they will cut properly?
For example: XbaI is added to the 5’ end of the forward primer:
5’-xxxTCTAGActatgtgtgtgctatctttcc-3’
How many x should be added? What kind of x (A, T, G or C) should be added?
Anywhere can I find such information to answer my questions? |
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v***a
发帖数: 1242 | 15 用的是promage的pCI-neo，要克隆的蛋白序列非常不好设计引物，最后选定了MluI (
1102)和XbaI (1114)，可以PCR得出来，但是后续的不知道是哪出了毛病，cloing一直
不成功。 排查到现在，想到是不是因为两个RE sites紧连在一起的缘故？大家有试过
这样吗？
谢谢！ |
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l******o
发帖数: 103 | 16 Thank you all for the kind reply.
1. I did not check the whole 4kb cDNA after site-direct mutagenesis. I sent
it for sequencing yesterday.
2. After screening positive colonies by PCR, I midi-prep DNA and transfect
into mammalian cells. After 24h, cells were harvested and directly boiled
with sample buffer. I run SDS-PAGE and probed the membrane with Ab against
the epitope. The original clone got good expression.
3. I cut the original clone with XbaI (see the following agarose gel photo).
The 4kb... 阅读全帖 |
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r****r
发帖数: 36 | 17 Keep at RT in all steps.
BTW, from your gel image, it seems like your XbaI sites were gone in new
construct. |
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n*******l
发帖数: 190 | 18 I want to use XbaI site on EGFP vector, but it is methylated by dam.
What should I do?
1. grow in dam- E. coli. which strain is the best?
2. change the multiple cloning site of Xba1 by mutagenesis
3. change my DNA fragment using PCR to add an RE site.
Sorry I can not type Chinese with working computer. |
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