T**********t
发帖数: 1604 | 1 降低非特异性结合应该是表面活性剂的任务吧，BME一般是用来防止二硫键形成产生二
聚体或者多聚体的。 |
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f*****f
发帖数: 195 | 2 方法很多：
一种是稳定的dimer，比如二硫键形成的dimer，SDS lysis buffer 也不能破坏，
Western blot会有两条带，刚好两倍差别。一定要确定的话可以IP后可以mass-spec
二假如SDS lysis buffer 会破坏，可以先IP后，sucrose gradient或是分子量层析，
至少有2个component
三，假如蛋白能纯化出来的，就更容易了。直接GST-protein过分子筛。
四，IP或pull down用外源蛋白可以沉淀下endogenous protein，说明可以形成dimer或
polymer
五，X-ray and structural determination确定dimer结构 |
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c********n
发帖数: 225 | 3 谈谈和蛋白打交道的日子 （六）
引子
以前常和朋友谈起什么行业就业机会多，有长期稳定发展的潜力。翻来覆去后总结的是
，围绕着“生老病死，衣食住行”就靠谱。说到饮食，应个景，《舌尖上的中国》II谈
到了饮食与人文的关系，也用到了一些科学名词，比较煽情。而我比较喜欢的一档美国
cooking show，是Alton Brown在Food Network的“Good Eats”节目, 真正的touch了
一些美食背后的科学小常识, 做到了寓教于乐，fun。这篇就讲讲和食品相关的一些体
会吧。
第六篇 舌尖上的冒险
我们这里对于牛奶， 奶酪， 冰激凌等的要求是较高的。 对于我，尤其钟情冰激凌。
学校食品系研究生们的课题经常涉及各种口味和口感的冰激凌。他们常做的一个实验是
大众品尝评分， 就是给体验者每次几个相似的样品和一张问卷， 给各项指标（比如口
味，口感，甜度，等等）打分。 一般都安排在春季学期的尾巴和秋季学期的开始，大
约在午饭时间。做研究生的时候刚好在这个系的对面楼里， 每次都可以积极地参与，
经常午饭都省了。
由于大众需求，在食品系的一层，开了一个卖冰激凌的柜台，每过一阵子就有一种... 阅读全帖 |
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g*******0
发帖数: 3240 | 4 人家和一个外行较真什么?
前面我就说了,别人问我,我也会含糊过去.
私下里讲话,和发布正式看法是不一样的.
中国的成名生物学家,比如王晓东,饶毅,施一公哪个在比较正式的场合认为这个陪得奖
了.
饶毅对生物学史特别有研究,特别推崇的单子中,这个都排不上.
事实上,中国搞这个胰岛素的专家,
我和几个人当年的小卒(现在也称为名教授了)还颇认识.
我本人也搞过短肽合成.
其中上,在这个项目中绝大部分是体力活.
技术含量最高的是邹承鲁先生主持的二硫键连接部分.
这块很有独创性,也是中国产物活性比较高的主要原因. |
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发帖数: 1 | 6 免疫球蛋白就是抗体，老干部有事儿没事儿就打抗体玩儿，是活腻歪了吧
免疫球蛋白（Ig）指具有抗体（Ab）活性或化学结构，与抗体分子相似的球蛋白。 免
疫球蛋白是由
两条相同的轻链和两条相同的重链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。 免疫球蛋
白分为五类，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免
疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）。 |
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d*********o
发帖数: 6388 | 7 http://science.caixin.com/2020-03-10/101526576.html?originReferrer=weibo_caixinwang
bioRxiv论文的通讯作者之一、中国科学院西双版纳热带植物园副研究员Alice
Catherine Hughes对财新记者表示，“人工干预没有任何证据，这种病毒显然（
clearly）是从野生动物起源和进化而来的。”
研究认为，来自蝙蝠的冠状病毒可能提供了新冠病毒的基因骨架，与蝙蝠或其他野生动
物的进一步重组事件，则使它获得了S蛋白、RBD和多碱基剪切位点
【财新网】（实习记者 黄晏浩 记者 徐路易）新冠病毒又一项“特殊性”在自然界中
找到了类似物。3月6日，一篇发表在bioRxiv预印本网站的论文称，S蛋白两个亚基S1和
S2间的蛋白酶切位点有多个氨基酸插入，并非新冠病毒独有，一种新的蝙蝠冠状病毒
RmYN02的S蛋白同样存在类似插入。研究团队认为，这一结果有力证明了类似插入可以
自然发生，新冠病毒起源于蝙蝠和其他野生动物中存在病毒之间的多重自然重组。论文
尚未经过同行评议。
该论文题目为《一种新的蝙蝠冠状病毒揭示了... 阅读全帖 |
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r****o
发帖数: 105 | 8 BSA这里起类似与分子伴侣的作用，主要是防止酶蛋白发生
由疏水相互作用引起的聚合和沉淀。也有可能起避免残存
蛋白酶分解酶蛋白的作用。不管怎么样，主要是为了稳定酶了。
别的添加物比较常见还有：
(1)甘油：也是避免疏水作用引起的蛋白质聚合。尤其可以保护酶
在溶解/冷冻时得活性。
(2)EDTA：可能是为了消除少量protease 的活性，从而使酶蛋白不
会被分解吧。
(3)DTT/BME: 还原剂。防止形成蛋白质分子之间非天然的二硫键。从
而防止蛋白发生聚合。
(4)Sodium Azide: 毒药。抑制微生物生长。如果长期保存蛋白，加
这个会有帮助。
(5) 其他比较常见的盐或者温和的去垢剂：帮助蛋白保持可溶状态。
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r****o
发帖数: 105 | 9
核内和proteasome的标记我不知道。不过内质网和高尔基体
你可以分别用PDI抗体和giantin抗体，应该很多地方都有卖的。
PDI是蛋白质二硫键异构酶，C端有很典型ER retention signal,
很严格的只存在于内质网里头。Giantin则是cis 及其medial
高尔基体上的一种膜蛋白，是很好的高尔基体的标识物。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 11 DTT是还原二硫键用的，一般用来保护蛋白不形成oligomer。在这里估计是用来保护T4
DNA ligase的。 |
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h*****t
发帖数: 1226 | 12 redcuing gel? if so, you will not see dimer, maybe it is just a contaminant |
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v***a
发帖数: 1242 | 13 大约于？是约大于的typo吗？
有时也可能是不同组织细胞中蛋白会有不同的modification，或者isoform，分子量就
会有上下浮动的。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 14 if you don't add dtt in loading buffer,
you could see dimer.
I AM doing this experiment now... |
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O******e
发帖数: 4845 | 15 You are right. But I'm more comfortable of using native gels to study
oligomers. |
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i*****e
发帖数: 286 | 16 他研究生物合成的，一个cluster就是好几个酶．没办法一一做透．
Wiki了一下你说的那个人，说他是第一个用ＤＴＴ还原二硫键的人。让我想到另一个牛
人，就是邹承鲁(Tsou CL)．读过他的文章，绝对不水,逻辑严密推导规范表达清楚，敬
仰～～ |
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x***o
发帖数: 47 | 17 我的蛋白过Ni盐浓度是500mM，上分子筛时换成200mM，请问蛋白聚集除了二硫键还有其
他什么原因吗，谢谢。 |
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S*********s
发帖数: 304 | 18 10%就高了？
比这高的多了去了
并不一定都是二硫键 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 19 10%还好，不算多。
有可能含有zinc finger一类的结构，不一定是二硫键。 |
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p****s
发帖数: 3153 | 20 我觉得这老板胡出主意，要是真菌植物那么好做大家都还用大肠杆菌干嘛？关键你没说
清楚，蛋白是可溶的还是在包涵体里？如果是可溶的为什么能用包涵体复性？“切”是
什么意思？cysteine这种东西不能用过氧化氢吧，很容易氧化成磺酸。以前没人做过这
个蛋白么？找找类似的文章。 |
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C*********m
发帖数: 213 | 21 查granulin 的NMR 结构文章在protein science上,是用变性复性，HPLC纯化的。 |
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C*********m
发帖数: 213 | 22 还有,可以用thioredoxin-tag试试，纯化的时候不加还原剂。 |
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W*****o
发帖数: 1780 | 23 Vector pET22b is good at expression of soluble proteins with disulfide bonds
in E.coli without any tag. |
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m**a
发帖数: 1228 | 24 先试试这个
我们以前一个类似的蛋白就是用pET22b在
periplasmic表达的
纯化的时候freeze/thaw，不用破菌
bonds |
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J********n
发帖数: 534 | 25 是不是Se-Met置换会导致蛋白溶解度降低?
不一定。not necessarily.
另外是不是Se-Met容易被氧化,需要用什么措施来保护?
我自己从来没有遇到过，不过看到有过这类的paper。如果是intracellular蛋白，没有
二硫键的，加点TCEP或者b-Me就好。 |
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l****z
发帖数: 29846 | 26 好像图转不过来. 这是link:
http://snowball5212.blog.hexun.com/70784459_d.html
中国人一直自称是中国人首次人工合成了胰岛素, 也是首次人工合成蛋白质, 并为这一
成果没有获得诺贝尔奖而不平, 时常有人说“诺贝尔奖是西方人的奖”时就会提起这茬
。中国人率先人工合成蛋白质, 这确实是官方说法, 并出现在中小学历史教材里, 作为
共和国科技发展迅猛的案例。
具体报告时间可以在上图中看到, 以上两图片来自《结晶胰岛素的全合成》一书。
但是, 国际上根本没有承认这一“伟大成就”的“伟大”, 甚至归功他人。在THE
HISTORY OF INSULIN 一文里, 提到“In fact, insulin was the first protein to
be chemically synthesized in a laboratory, in 1963. ”，你会注意到, 这比我国
所说要早了两年。在《Insulin & related proteins: structure to function and
pharmacology》一书... 阅读全帖 |
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V***b
发帖数: 3419 | 27 这些蛋白的折叠不需要很多帮助吗？比如chaperone，lectin，folding enzymes...？
另外细胞质里的蛋白都没有二硫键，糖基化吗？
唉，大学课程没学好啊。 |
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a******7
发帖数: 7936 | 28 是啊，培养液中为什么加b-ME啊，这玩意不是做western的时候用来保持蛋白完整性的
么？跟二硫键有关 |
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z*******n
发帖数: 4 | 29 谢谢！
我希望是可以消化掉污染的DNA的那种，例如常用的DNase I，我记得好像这个酶有二硫
键。
我就是没有什么头绪。我想除了上面这个酶，应该还有一些其他种类的DNase吧。 |
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e**e
发帖数: 166 | 30 你的建议很好。 我的蛋白复合体应该是二硫键结合的。 我的蛋白盐析以后用PD１０去
盐， 浓缩用Amicon。 活性保持的还可以。所以离子柱应该不会破坏蛋白。
请问离子柱和分子筛你有什么推荐的产品吗？ |
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p****p
发帖数: 3360 | 31 subunits之间二硫键算不算？sumoylation? |
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z*********s
发帖数: 38 | 32 二硫键做的太多了，SUMO，ISG15，Fat10，Nedd8这些都算在UBL里面。除了这些以外还
有吗？比如两个不同的蛋白质或者蛋白质亚基之间通过K和D，E连接，或者通过K和Q连
接？是生物体内天然的那一种 |
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w****6
发帖数: 169 | 33 cys残基是主要的target residue。一般比如有glutathionylation。另外 protein
disulfide isomerase family member 也会响应氧化还原电势的变化从而催化改变蛋白
cys残基的状态，比如形成二硫键，或复合物等等。 |
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l******a
发帖数: 3339 | 34 兄弟，别激动，知道二硫键是怎么work的吗？别太付责任了。 |
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l******a
发帖数: 3339 | 35 我说的还不够明白吗？不都说了二硫键了吗？
the disulfide bond holding antibody to fold will get reduced inside the cell. |
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z********i
发帖数: 610 | 36 You may have another choice. Sortase
We use this method a lot. |
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p*********3
发帖数: 44 | 37 但有多个二硫键时如何确定半胱氨酸之间是怎么配对的呢？
的蛋
MGF |
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s********d
发帖数: 47 | 38 你前期处理注意disulfide bond shuffeling这个问题了吗？
我做过很多用质谱定位二硫键的实验。发现最大的问题是disulfide bond shuffeling.
解谱用软件就好了，再加手工判断一下谱图的质量。有成熟的软件可分析。如果有兴趣
，给我留言或者发邮件吧。 |
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l*******k
发帖数: 63 | 39 谢谢您的建议！其实我们还设计了一组实验，就是用NEM先block thiols再用CysTMT来
做label，这组实验我们是打算作为一种“indirect”验证方法的，因为我这个蛋白有
两个subunit，一共好几十个Cys，如果用手工的方法来找，真心太麻烦了，现在有不少
检查二硫键的软件可以使用，但是其accuracy和precision还真的有些难说。
的蛋
MGF |
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c******n
发帖数: 16403 | 40 thioamide不容易被还原， 容易被氧化。 你的DTT质量好么？ 如果DTT已经形成了二
硫键， 说不定它把thioamide氧化了。 |
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D******n
发帖数: 76 | 41 比较biologically interesting的，没有二硫键的，不是贵的离谱的~有推荐没？ |
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a*****m
发帖数: 13 | 42 因为怀疑现在用的一些含硫脲的化合物可能与蛋白质中的半胱氨酸缓慢起反应，但是不
太确定，问问二者能其反应么？是生成二硫键么？
谢了 |
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f**********r
发帖数: 91 | 43 PH>7. DTT如果浓度在0.5mM，有还原能力吗？这种还原/断裂反应一般需要多长时间
？谢谢了。 |
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o****e
发帖数: 1011 | 44
广义说来，浓度再低，DTT也都有还原能力。
浓度主要影响的是反应速率。一般情况是浓度越低，反应速率越慢。
除了反应物(DTT，-S-S-)的浓度，影响这个反应的因素还很多，反应时间几分钟、
几小时都有可能。比如pH对DTT的还原性能影响很大，pH10一般要比pH7要快很多；
另外比如小分子的disulfide bond一般比"包在里面的"、大分子里的要容易反应。
当然，条件许可的话，升温也能加速反应。 |
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s**********4
发帖数: 82 | 45 加点碱， TEA或者DBU啥的，半小时就够了，只要你DTT量够。 |
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