v********a
发帖数: 646 | 1 关于RNA-protein的免疫沉淀，我有两个问题一直想请教。因为基础不好，请大家不要
见笑。
1、组织裂解之后，加等量的lysate分别和IgG ctrl和P53 Ab 孵育。
请问: 在这里IgG ctrl组和p53 Ab组分别要做三个或三个以上的重复么？
还是每次只做一管的IgG ctrl和P53 Ab ，把同样的实验重复三次，从而得到结果？
2、为什么发表的文章里面，许多IP实验图里，都要loading一个什么10% input的样品？
3、IP实验如何控制误差？
谢谢哈 |
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k****o
发帖数: 589 | 2 最近几天用Pierce的Seize X Protein A kit做IP，要沉淀的是一个膜受体。用的抗体
（兔IgG）应该没有问题，因为做WB和flow cytometry都成功。使用了DSS让抗体和
Protein A交联。用了300～400 ug total protein沉淀，4度翻转过夜。之后清洗用的
是自己照着kit说明配的PBS,用kit自带酸性elution buffer洗脱，收集了3个组分。可
是之后用SDS-PAGE+WB检测，受体的带完全没有。我知道这个受体肯定是表达的。请问
可能原因有哪些？
另外Seize X的kit刚好用完，有没有什么其他的kit便宜质量又不错的？曾经考虑过
dynabeads，但是貌似还得另买一台磁力沉淀器？
多谢！ |
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g*********5
发帖数: 2533 | 3 western 合适的抗体不一定适合免疫共沉。
可能抗体识别位点在复合体内部。 |
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m********2
发帖数: 317 | 4 p53免疫共沉淀以及其结构
老板让我免疫共沉淀p53，然后测其结构。我对这一个领域不了解，想问问大家。
第一，有没有好用的kit or protocol来免疫共沉淀p53。
第二，免疫共沉淀出来的p53能否用来测结构。
第三，解构需要的蛋白量是多少?
谢谢大家， |
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g*********d
发帖数: 233 | 5 目前表观遗传学(Epigenetics)通常被定义为基因表达通过有丝分裂或减数分裂发生了
可遗传的改变, 而DNA 序列不发生改变[1, 2]。表观遗传学的机
制主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA。DNA 甲基化(DNA methylation)是指
在DNA甲基转移酶(DNA-methyltransferases, DNMTs)的催化下, CpG 二核苷酸中的胞嘧
啶被选择性地添加甲基, 形成5-甲基胞嘧啶[3, 4]。DNA 甲基转移酶有两种, 其中
DNMT1 主要起维持甲基化的作用, 能使半甲基化的DNA 双链分子上与甲基胞嘧啶相对应
的胞嘧啶甲基化, 可参与DNA 复制双链中新合成链的甲基化[5]; 而DNMT3a 和DNMT3b
主要起形成甲基化的作用, 能在未发生甲基化的DNA 双链上进
行甲基化[6]。DNA 甲基化一般与基因的沉默相关,DNA 去甲基化则与基因的活化相关[7
~9]。
组蛋白修饰(Histone modifications) 是指组蛋白的基础氨基末端尾部突出于核小体,
常在转录后发生变化, 包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等翻译后的修饰... 阅读全帖 |
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w*p
发帖数: 16484 | 6 实验室检验科的水平太烂，医生跟病人交流的水平也非常烂
《全国艾滋病检测技术规范（2009年版）》（以下简称《规范》），严格进行。
一、HIV抗体检测
HIV抗体检测不同于其他病原微生物的检测，任何错误的诊断，包括假阳性或假
阴性，都会对被检者甚至他人造成重要的影响。因此，HIV抗体检测必须严格按照《规
范》要求，由接受过专门技术培训并获合格证书的技术人员在当地卫生行政部门审批合
格的实验室中进行，整个实验过程应有严格的质量保证体系。
HIV抗体检测分为筛查试验和确证试验，可用于诊断（确定个体HIV感染状况）、
监测（了解不同人群HIV感染率及其变化趋势）及血液筛查（防止输血传播HIV）。筛查
试验根据检测原理不同分为酶联免疫吸附法、凝集法和层析法，可对血液、唾液和尿液
标本进行常规或快速检测。临床用于血液筛查的方法包括酶联免疫试验（ELISA）、免
疫荧光法、化学发光法等，常用的为酶联免疫法（ELISA）。自1985年第一代ELISA试剂
问世以来，随着医学技术的发展，包被抗原已从一代的全病毒裂解物发展为目前以基因
重组和多肽抗原包被... 阅读全帖 |
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f***y
发帖数: 4447 | 7 https://tech.sina.com.cn/d/f/2019-07-19/doc-ihytcitm3069024.shtml
今天凌晨，最新一期《科学》以研究长文的形式在线发表了中国工程院院士、南开大学
校长曹雪涛课题组的论文。
据论文报道，课题组发现了机体感知与甄别入侵病毒DNA的一种新型天然免疫识别
受体，被称为hnRNP-A2B1的该受体分子，能够在细胞核内特异性地识别病毒DNA，随后
激活天然免疫信号通路和诱导干扰素产生，启动天然免疫应答反应以清除DNA病毒的感
染。
该工作开辟了天然免疫与炎症研究领域的新方向。
突破“禁区”
免疫，是一种重要生理功能，机体依靠这种功能识别“自己”和“非己”，破坏和
排斥入侵的病毒等病原物质，维持自身稳定。
经过多年探索，科学家们在识别外源病原体DNA的分子机制及其抗病毒免疫研究上
取得长足进展。
目前发现的能够识别病毒DNA的天然免疫受体都存在于细胞质中。
例如，2013年，《科学》报道了华人科学家陈志坚团队的重大发现—— 一种被称
为cGAS的蛋白能够识别细胞质里的病毒DNA。
不过，绝大多数DNA病毒感染宿主细胞后会进入细胞核内释放... 阅读全帖 |
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g*******f
发帖数: 427 | 8 我想用一个蛋白的抗体来免疫沉淀这个蛋白，目的是要从组织中富集这个蛋白用来做质
谱看它的在体内的修饰情况。
我用抗体沉淀蛋白后，加dynabeads protein G,洗脱后跑western blot 看蛋白有没有
被沉淀下来。western blot用做IP的抗体检测，发现在55KDa有非常强的带，但是我的
目的蛋白是40KDa, 这个带应该不是protein G，因为protein G 只有17 kDa。 我想请
问这个带会是什么呢？用什么抗体做western blot 来检测这个ip 后的产物比较好？
多谢了 |
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s********x
发帖数: 472 | 9 你的detergent应该可以溶膜了，沉淀主要是细胞骨架。
看看你的蛋白是不是和骨架结合吧。
还有可能是过表达 折叠不好 根本不溶。
看看免疫荧光是不是有聚集。 |
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p*****n
发帖数: 981 | 10 ☆─────────────────────────────────────☆
giantbird05 (大鸟) 于 (Thu Jan 25 20:19:46 2007) 提到:
要裂解几十个T75 FLASK的细胞，然后用抗体把裂解液中的蛋白拉下来。。
裂解液的要几十毫升，我想浓缩一下，但是怕变性影响以后的免疫沉淀。
高手请进，帮我指导一下。
多谢了。
☆─────────────────────────────────────☆
pigskin (六如) 于 (Thu Jan 25 20:23:50 2007) 提到:
裂解液中的蛋白浓度已经很高了。。。
不好浓缩，而且容易把目标蛋白搞死。
☆─────────────────────────────────────☆
KingofMS (offer来了，H-1B没了。我苦) 于 (Thu Jan 25 20:24:05 2007) 提到:
columns packed with C4 (based on hydrophobicity)?
☆────────────────────────────── |
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t********y
发帖数: 6 | 11 当然也在4度下.
看文章多数是抗体+细胞裂解液两样摇过夜,第二天再上珠子,可我这样做拉不下蛋白.
如果三样同摇,条带倒有了,又怕是非特异.卖我抗体的说他们就这么做(摇三样过夜)没
问题,IgG也不会有条带,结果我这么做IgG对照又有条带!(不过我这个IgG质量也有些可
疑)
其他方法也在试,如果加大IP抗体的量吧,似乎珠子就有些凝聚成坨,似乎也加大非特异
的风险.
有没有人有经验指点一下,这么做行么?谢谢了 |
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b**e
发帖数: 120 | 12 我都是这么做的，没问题，IgG有非特异性带的问题你再摸下条件，可能抗体本身有交
叉反应。 |
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t********y
发帖数: 6 | 13 唉会不会也有可能使santa crutz的珠子质量不佳 |
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p****p
发帖数: 3360 | 14 从大量的细胞中提取总蛋白，用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS－PAGE，
coomassie 染色，在70k那里割胶，mass spec。 |
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g*******f
发帖数: 427 | 15 最近在做 ChIP 看PPARgamma 的转录调控，一个月了也没出什么结果，用的是
Millipore 的EZ ChIP Kit, IgG阴性对照总是出现挺强的带，， RNA Polymerase2 阳
性对照的带却很弱，似乎没有理由怀疑试剂盒的RNA Polymerase2 抗体有问题啊? 以前
做NF-kappaB 一直都做得挺好的，只是用的是不同的试剂盒而已。 还请做这个方面的
指教一二。多谢了
BTW，偶然翻到了尚永丰的主页，上面有这么一句 "在世界上首次建立了哺乳动物细胞
染色质免疫沉淀技术（ChIP）"
http://www.bjmu.edu.cn/art/2009/12/6/art_8_39651.html
让我觉得挺 shock 的，原来这个技术是他"建立"的 难以置信啊 |
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g*******f
发帖数: 427 | 16 最近在做 ChIP 看PPARgamma 的转录调控，一个月了也没出什么结果，用的是
Millipore 的EZ ChIP Kit, IgG阴性对照总是出现挺强的带，， RNA Polymerase2 阳
性对照的带却很弱，似乎没有理由怀疑试剂盒的RNA Polymerase2 抗体有问题啊? 以前
做NF-kappaB 一直都做得挺好的，只是用的是不同的试剂盒而已。 还请做这个方面的
指教一二。多谢了
BTW，偶然翻到了尚永丰的主页，上面有这么一句 "在世界上首次建立了哺乳动物细胞
染色质免疫沉淀技术（ChIP）"
http://www.bjmu.edu.cn/art/2009/12/6/art_8_39651.html
让我觉得挺 shock 的，原来这个技术是他"建立"的 难以置信啊 |
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K*F
发帖数: 120 | 17 某实验室寄给我针对某一个蛋白质motif的一个单克隆抗体（未经过纯化的小鼠腹腔液体），小弟正
在做对该motif的免疫沉淀。做了两次，run gel之后可以略微看到条带，但是明显亮度太浅了。我
的positive control是Qiagen公司的5xhis单克隆抗体，我的蛋白质80%-90%可以被pull
down下来。所以我需要对我的单克隆抗体进行浓缩，而且那个实验室的postdoc也告诉我，他们也
是浓缩了做IP。
问题：
（1）我只有1ml的单抗 （未经过纯化的小鼠腹腔液体）。我时候需要用Pierce公司的
protein A column进行纯化？1ml腹腔液体够么？
（2）我能不能不经过protein A column纯化，直接用Minipore的浓缩用的柱子进行抗
体浓缩？ |
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V********n
发帖数: 305 | 18 仅供参考。
可能出的状况
1）不理解为什么要用DSS？交联后抗体是否还有活性需要检测。
2）elution buffer是否能洗脱目标蛋白？建议直接加上样buffer。
3）细胞裂解条件是否合适，IP时的buffer条件是否合适？做IP的细胞裂解条件是否和
之前WB检测时的一致。膜蛋白可能需要比较强烈的buffer条件。但同时，IP的buffer条
件可能不能太极端，需要摸条件。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 19 你用DSS是因为不想在elution里看到IgG吗？
如果你那个蛋白的size离heavy chain light chain不近，
你先试试不用cross-link做IP好了……
你elution volume是多少？都跑胶了吗？
如果volume大可以concentrate一下，全跑
这个KIT你可以自己order各个试剂，elution buffer也可以找到recipe啊
另外，顶楼上，膜蛋白不好做，搜一搜别人的paper，看用的是什么条件
IP的抗体也要多试几个……
300-400ug有点少啊，多弄点sample啊 |
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k****o
发帖数: 589 | 20
谢谢，我用的抗体是Santa Cruz的，去查了查公司网站，发现是可以用来做IP的。 |
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k****o
发帖数: 589 | 21
用DSS是为了让抗体不被洗脱，以后还可以重复用agarose beads。交联这一步我是严格
按照厂家的protocol做的。Elution buffer根据厂家描述是酸性，pH2~3。洗脱应该是
没有问题的。洗脱后没有中和pH,但是厂家说这样没有问题。细胞裂解用的是Cell
Signaling的lysis buffer，用来做相同蛋白的WB从没有问题发生过。
你是建议我用Laemmli Sample Buffer洗脱吗？这样即使洗脱，agarose beads也无法重
复用了吧？ |
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k****o
发帖数: 589 | 22
用DSS一是不想看到IgG的带，还有就是当初想重复用agarose beads，因为IP需要的抗
体量太大了，想省钱。
洗脱体积是190 ul，IP前的total protein加了350 ug，洗脱后用了36 ul跑胶。
用那么多蛋白做IP实属无奈，我用的是原代细胞，只有那么多量。
请推荐个浓缩洗脱组分的办法吧，可以的话我打算把剩下的样全跑胶了。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 23 this company....
got good antibodies just like to draw a lottery... |
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V********n
发帖数: 305 | 24 个人建议。不要光想着省试剂钱，你的时间也很值钱的。不如用最优化的条件做一遍，
得到正结果后再改进来省银子。几点你可能需要注意。
１）SC的抗体很多不靠谱。当然，也有好的。
２）最好不要用DSS。蛋白交联情况和处理时间有关，结果无法用其他实验验证。如果
是这一步的问题，你都无从查找。
３）低PH洗脱液可以从Agarose上洗脱抗体，但是否能保证打开蛋白－抗体的结合未知
，与多种因素相关。
４）你IP时的缓冲体系是什么，不会是１XCS的裂解液吧。
５）你蛋白上样太少了。直接加小体积上样Buffer煮，全上了做WB。
６）膜蛋白IP不好做。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 26 虽然SC说抗体能IP，建议你最好用自己的sample做个routine的IP+Western试一下。确
定能IP了，再考虑CROSS LINK？
有关重复用agarose beads的问题
1 IP需要多少抗体？没觉得省很多啊……既然用的是原代细胞，你的DISSECTION和
CULTURE的人工费用应该比抗体贵很多吧
2 要确保经过 1和DSS反应 2被ELUTION buffer摧残 后的抗体仍然好用……
浓缩洗脱组分（随便换buffer或者desalt）可以用spin column，
参见
http://www.life.sci.qut.edu.au/epping/LSB607OLT/607concentrator |
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k****o
发帖数: 589 | 27 多谢大家帮忙！下次试试不加DSS，浓缩洗脱组分。抗体差不多用完了，也可以换家试
试。 |
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k****o
发帖数: 589 | 28
多谢，关于第四个问题，我用的是裂解液和wash/binding buffer (类似PBS) 1：1混合
。有更好的办法吗？ |
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l**1
发帖数: 64 | 29 同济大学生命科学与技术学院江赐忠课题组招聘启事
诚聘副研究员（湿试验）一名
本研究组主要从事表观遗传基因调控机制。研究角度主要从胚胎和干细胞(ESC与iPSC)
两个层次。主要技术包括ChIP(染色质免疫沉淀)、高通量测序、生物信息学和基因组学
等手段。实验室主页见 http://www.tongji.edu.cn/~czjiang 。
待遇：
采用新机制进入同济大学高等研究院，对于优秀应聘者提供具有国内竞争力的特别薪酬
资助。
资格要求：
1. 具有2年或以上博士后经历；
2. 在生命医学领域做出过出色成果，以第一作者或通讯作者（均含并列）在本领域国
际知名SCI期刊上发表过文章；
3. 有很好的英语阅读、写作和交流能力；
4. 工作认真踏实，学术道德良好，有责任心、钻研和协作精神，能独立开展工作，具
有较强的发现问题、解决问题的能力，具有很大的学术发展潜力。
工作内容：
以果蝇与干细胞为模型，运用ChIP-seq技术，结合生物信息学手段，研究分析胚胎发育
、干细胞多能性维持与分化、重大疾病发生发展中关键组蛋白修饰、核小体重塑、特定
转录因子间的相互作用，及表观遗传基因调控机制。（掌... 阅读全帖 |
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l**1
发帖数: 64 | 30 同济大学生命科学与技术学院江赐忠课题组招聘启事
诚聘博士后2名
本研究组主要从事表观遗传基因调控机制。研究角度主要从胚胎和干细胞(ESC与iPSC)
两个层次。主要技术包括ChIP(染色质免疫沉淀)、高通量测序、生物信息学和基因组学
等手段。实验室主页见 http://www.tongji.edu.cn/~czjiang 。
待遇：
在同济大学博士后标准的基础上，课题组对于优秀博士后将提供具有国内竞争力的特别
薪酬资助。
资格要求：
1. 具有博士学位；
2. 在生命医学领域做出过出色成果，具有学术发展潜力；
3. 工作认真踏实，学术道德良好，有责任心和协作精神, 可独立开展工作，具有较强
的发现问题、解决问题的能力。
工作内容：
湿试验博士后：
以果蝇与干细胞为模型，运用ChIP-seq技术，结合生物信息学手段，研究分析胚胎发育
、干细胞多能性维持与分化、重大疾病发生发展中关键组蛋白修饰、核小体重塑、特定
转录因子间的相互作用，及表观遗传基因调控机制。（掌握下列技术者优先: 细胞培养
、干细胞分化、ChIP）
生物信息学博士后：
分析RNA-seq、ChIP-seq、MeDIP等高通... 阅读全帖 |
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y********g
发帖数: 782 | 31 大家有做过内源性的IP吗？就是不做转染，不加TAG的那种？
大家有protocol可以share一下吗？
我做了几次，都是连pull down的蛋白都看不到。
看了别人的paper，大部分都是用了tag的。但是老板说，不用tag也能出来bank。做了
几个月了，不知道大家有没有什么好的建议？
另外，就是IgG的unspecific bands实在是太多了，从20-60Kda都是很强的带，我用1ug
的抗体~~~ 我需要的蛋白在65 和 85左右，旁边带很强，看不到target的带。
很崩溃~~
求大牛指点。伪币答谢吧~~谢谢啦~~~ |
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C*****h
发帖数: 926 | 32 抗体可能有问题。
先做个western blot再说。
1ug |
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s**a
发帖数: 293 | 33 也许内源表达太低测不到……全细胞裂解液的 positive control 有没有条带？
没的话换用高灵敏度的发光底物试试
1ug |
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A******y
发帖数: 2041 | 35 You need to cross-link your ab to your beads, magnetic beads work best but
some antibodies can not handle the cross-link. You also need a lot more
antibody ~100ug and a lot of cells for native pull-down. I use one T-25 for
native IP. |
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s***a
发帖数: 671 | 36 用light-chain specific的二抗可以解决你IgG的背景问题。
1ug |
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a****l
发帖数: 125 | 37 why use T-25? T-25 is not very big, so there are not too many cells. why don
't use T-75?
for |
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y********g
发帖数: 782 | 38 全细胞裂解液有条带，western 也是work了~~ 主要还是2个问题，最主要的一个还是背
景太高。 我用抗mouse的pull down，用抗兔的蛋白检测，还是很多的背景杂带~~~
大家beads是怎么clear的？
我看protocol 通常有3种
1）先加Beads到样品中，然后把上清移到另一个管子里，然后再加beads和抗体过夜。
2）先将Beads和裂解液（不是样品）混合，rotate 1h，然后再离心，把preclear的
Beads+抗体+样品液 混在一起4度过夜。
3）将抗体和样品4度过夜，然后把Beads加进去，4度转4h左右。
3种方法，哪种背景更少啊，还是说差不多？谢谢大家了 |
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A******y
发帖数: 2041 | 39 You can use a T-75. It's easy for me because I have too many conditions and
it works at that amount of cells (I have lymphocyte, too). There are some
pull down require minimum of T75 or larger.
don |
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c********b
发帖数: 363 | 40 不要用二抗，用protein a-hrp会好些 |
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n****n
发帖数: 434 | 42 there are too many answers to the problem:
1. cell types (find a higher expression cell type or line)
2. antibody quality (antibody are NOT universal, being good for western does
not mean good for IP. if the antibody was never tested for IP, you can try
dilution factor/incubation time. use of transfected lane as control will
help [can you IP your transfected target using both your antibody and anti-
TAG?]. try different antibody from different source)
3. your IP skills (by no means i look down a... 阅读全帖 |
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i**********a
发帖数: 1402 | 43 一般就是抗体的问题，或者是buffer的问题。换个抗体试试。 |
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a****l
发帖数: 125 | 44 再请教一个, 100ug 的抗体是不是太多了? 算起来要上百 ul 的抗体....
for |
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L*******e
发帖数: 2153 | 45 yep! this is the right way~
for |
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l**1
发帖数: 64 | 46 同济大学生命科学与技术学院江赐忠课题组招聘启事
本研究组主要从事表观遗传基因调控机制。以果蝇与干细胞为模型，运用ChIP-seq技术
，结合生物信息学手段，研究分析胚胎发育、干细胞多能性维持与分化、重大疾病发生
发展中关键组蛋白修饰、核小体重塑、特定转录因子间的相互作用，及表观遗传基因调
控机制。主要技术包括ChIP(染色质免疫沉淀)、高通量测序、生物信息学和基因组学等
手段。实验室主页见 http://www.tongji.edu.cn/~czjiang 。
待遇：
受聘者将协助指导研究生。采用新机制进入同济大学高等研究院，具有国内竞争力的薪
酬和其它福利。副研究员:10-20万元/年，学校提供过渡廉租房。博士后8万起，学校提
供公寓住房。
应聘副研究员资格要求（湿试验）：
1. 具有2年或以上博士后经历；
2. 在生命医学领域做出过出色成果，以第一作者或通讯作者（均含并列）在本领域国
际知名SCI期刊上发表过文章；
3. 有很好的英语阅读、写作和交流能力；
4. 工作认真踏实，学术道德良好，有责任心、钻研和协作精神，能独立开... 阅读全帖 |
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b******y
发帖数: 627 | 49 yes, there is well established sucrose gradient centrifugation method. |
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r*****t
发帖数: 4793 | 50 这样，我主要想拿核糖体合的ｍＲＮＡ，有什么这方面的ｐｒｏｔｏｃｏｌ吗？ |
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