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r***e
发帖数: 2539 | 2 这个建议可以试试。
挑了单克隆你会发现，GFP表达少的细胞长的好。表达很高的很难活下来，所以另外一种
原因是GFP毒性。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 3 楼主，请问你用pTRIPZ lentivirus建立起来的细胞系是怎么操作的？
细胞染毒后稀释传代加药挑单克隆？还是只是加药筛选后pool所有的存活细胞？ |
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L*****t
发帖数: 56 | 4 老板负责学校一个生物技术课程的教务，自己也会带几个本科生。这次新进实验室的一
位，女，华裔，长相抱歉不过自我感觉良好。第一天参观实验室的时候居然端着一杯咖
啡一边喝一边打招呼，还没来得及阻止就被实验室主任看到了，一通训斥后此人眼望天
空一言不发，反而是我和老板不停的道歉。
第一个实验是LB平板上挑单克隆，此人称自己会做那我就我让她挑3-4个培养。在旁边
看了几秒就发现不对，用来挑菌的枪头居然不换就继续挑下一个，赶快叫停，花了10分
钟解释什么是无菌操作，确定她听懂了后我有事离开一会儿，回来的时候发现实验台上
一堆垃圾，还有一瓶没上盖子的培养液，人早已不知去向。
第二天做酶切的时候再次犯晕，吸过样品的枪头不换直接去吸酶。我指出问题，答曰“
这几个质粒应该都是一样的，为什么要换”。!@#$%^&* 这支全新的SmaI恐怕以后只有
她自己能用了。
双酶切第一步要求25度水浴培育一小时，重复了好几次都切不开，仔细询问后才明白此
人认为25度=室温，就把EP管在室温放了一个小时。问题是实验室常年缺乏日照，异常
阴冷，墙上的温度计显示室温是18度，当然切不开。最后是昨天把一个装着T4 Ligase... 阅读全帖 |
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p*****u
发帖数: 191 | 5 身为一名病毒学家，李文辉用“钓鱼”来形容自己的工作。
这位垂钓者的目标，是乙型肝炎病毒（HBV）的受体。这种细胞表面的受体分子，是
乙肝病毒及其卫星病毒丁型肝炎病毒（HDV）入侵人体所需打开的一把锁。找到这把锁
，将有助于深入了解乙肝病毒的感染机制，并为治疗乙肝及其相关疾病提供钥匙。
经过5年的研究，这位北京生命科学研究所的研究员和学生们一起，钓到了这条大鱼
。研究成果发表在11月13日的《eLife》杂志上，题为《钠离子牛磺胆酸共转运多肽是
乙型肝炎和丁型肝炎病毒功能性受体》。
“这一开创性的研究成果是有史以来本领域最优秀的科研论文之一，将重塑乙肝病毒
研究领域现行的研究模式。”乙肝病毒侵入研究领域的顶尖专家、德国海德堡大学史蒂
芬·伍本教授告诉中国青年报记者。他同时评价创刊不久的《eLife》是一份具有很高
水准的期刊。
对此，“渔翁”李文辉谦虚地表示：“能对这一领域做出改变，这是最值得我们高兴
的事。”
------寻找受体就像大海捞鱼，而且是有目的只钓某个品种的鱼——能够与乙肝病毒相
结合的鱼
“寻找受体就像大海捞鱼，而且是有目的只钓某个品种的鱼——能够... 阅读全帖 |
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l***g
发帖数: 19 | 7 没用过这个载体的病毒质粒，不是很清楚。为啥目的基因和GFP之间要有IRES连着，GFP
不能和目的基因直接融合吗？一般IRES和筛选基因连着比较有用吧。如果你的GFP阳性
率偏低并且表达量不高的话，可以试着病毒感染后再挑选单克隆细胞，挑那种表达量高
的。 |
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c*z
发帖数: 157 | 8 你是分子生物学的课题组还是药理药剂的？
如果前者的话，在细胞层面做好了，delivery搞不定就僵在那里了
不过可能后续工作老板都会找collaborator给你们做 |
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s****9
发帖数: 932 | 9 你至少应该简单介绍一下你的抗原，cytokine，receptor？这个receptor是activation
receptor？如果是，那么receptor有没有redundency？你的antibody是agonist还是
antagonist？
没有这些info，怎么能够预测pitfall？ |
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s****9
发帖数: 932 | 10 谢谢你的包子，看在包子的面子上，多说几句。
如果让提问题，可以提很多，
首先，做单抗的抗原是不是N Terminal，或者细胞外的部分。如果不是，抗体识别的
epitope很可能不是细胞外的部分。如果我做这个实验，首先就是把单抗结合上颜色（
eg. Alex488），用FACS染一下，看看能不能特异结合细胞外的抗原。
如果这个抗体识别的是细胞内的抗原。经典的免疫学认为，抗体不能够neutralize细胞
内的东西（当然，前年有篇PNAS说可以）。
如果可以识别胞外抗原，而且抗原是肿瘤特异的，那么很有意思。首先，应该看一下，
这个抗体对于抗原的结合能不能影响蛋白的功能。比如，overexpress 这个抗原之后，
加抗体，in vitro culture对肿瘤细胞的生长有没有影响。如果有，可以猜想它是一个
受体，抗体甚至有可能是个agonist。这样的话，这个project会变的很有意思。如果是
negative result，说明也推翻不了太多问题。
接下来，你当然可以直接打tumor（最好是overexpression的tumor把window放大）到
BALB/c上，然后打抗体看有... 阅读全帖 |
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c*z
发帖数: 157 | 13 lz也不要太绝望，你的课题和 HER2受体的herceptine 是一个路子
你的mAb已经拿到了么？如果还没有的话，你都不知道这个mAb是否binding在
functional region....
拿therapeutic antibody不像养做western的抗体这么简单，只要specific binding就
可以，你这个不是夹住蛋白身上任何部分就可以交差的。。。任重而道远啊
你加了这个蛋白细胞长的开心，不等于block了它就可以抑制细胞生长，其他通路或许
可以取代它，直接跳过这个蛋白让细胞生长
你的蛋白是受体还是配体倒是问题不大，block哪个都行
还有谢谢lz包子 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 14 不谢 都考古未名买买提 Bio 版的最近旧贴 得到的启发 没那些帖 俺就是一个Cre
mice 科盲
比如
楼主可以 结合楼下的跟贴
和以下的贴主 交流下 ERT2-Cre Mice genotyping Tips...
发信人: supersunday (Linda), 信区: Biology
标 题: ERT2怎么genotyping?
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jan 15 18:54:44 2013, 美东)
我们最近引进了两种Cre小鼠，一种是持续表达的，一种是诱导的(ERT2-Cre)。请问
ERT2怎么genotyping?怎么设计primer？我找了plasmid,是pCAG-ERT2CreERT2，没有找
到ERT2 site。
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31772553.html |
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l**********1
发帖数: 5204 | 15 Conti:
plus
多去参CSHLab 的有关年会 至少要了解年度的忽悠的新窍门 (+ +) or at least (+
-) 以防止旧 tips 已经失效喽 (- -)
pls refer,
Cancer Biology & Therapeutics
April 23 - 27, 2013
Abstract Deadline: February 8, 2013
Organizers:
ignored
HTTP: //meetings.cshl.edu/meetings/2013/tumbio13.shtml |
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S*********s
发帖数: 304 | 16 T2A
your-gene-T2A site-puro
在同一个mRNA表达，表达cDNA可以用。
google
The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A
site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’
sequences
inducible system
请参考
Wee, S., Wiederschain, D., Maira, S.-M., Loo, A., Miller, C., deBeaumont, R.
, Stegmeier, F., Yao, Y.-M., and Lengauer, C. PTEN-deficient cancers depend
on PIK3CB, Proc Natl Acad Sci U S A. 105: 13057-62, 2008
http://www.addgene.org/21915/
另外还有两载体系统
pCMV6-TetR
TO-shRNA
很多公司都有，google
你现在的stable ... 阅读全帖 |
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J******1
发帖数: 351 | 17 试剂盒里的（RNA Controls）不小心没放低温冰箱，一周左右
盒子里还有单克隆抗体，都放常温了，哎 |
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c**i
发帖数: 265 | 18 既然多克隆抗体是结合到同一个受体的不同位置，那么又没有可能多个多克隆抗体同时
结合到一个受体上，这样的话会不会比单克隆抗体有更强的结合能力（考虑到一个单克
隆抗体只能结合一个受体）。谢谢大家 |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 对，你说的非常好。关键就是这个接种方法不同。小提一般都是从板上的菌点接种，
而中提是在已经长起来的液体里接种。
其实在板上长的时候因为菌落里面有那个biofilm, 所以只要最底下一层是有抗性的携
带质粒的菌，顶上肯定也就是。而且零星长起来的突变抗性菌没有办法跑过去占他们的
地盘，所以菌种比较单纯。但是在摇的菌液里情况就完全不一样了，突变体很快就能取
代携带质粒的菌体，因为携带质粒其实对于细菌而言就和我们被感染了寄生虫是类似的
，都是个负担。
有一个小窍门就是把一个单克隆挑出来在板上满满的涂一大圈，然后长起来后把整层都
刮下来放到培养液里去再摇个８小时就可以做中提了。 |
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z********i
发帖数: 610 | 20 这种情况我也遇到过很多次。小提的时候一点问题都没有，中提的时候什么都没有，哪
怕是用250ml也提不出来。我一般都是重新转化，或者划平板，挑单克隆。就向楼上说
的一样。 |
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n********e
发帖数: 1630 | 21 我用50ml的培养液，不知道是中提还是大提。我直接从板上挑单克隆进入50ml，
overnight，产量500-1000ug |
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B******o
发帖数: 496 | 31 不好意思，白天太忙没上买买提。 我们已经筛好的细胞都是699.
如果需要customerized的话，一般而言我们从筛选开始2-3周deliver cell mixture，
一个月内做好单克隆。Inducible系统我们能拿到比较高的阳性克隆，一般筛12个，然
后挑最好的给你。你需要提供想要转入的基因，我们clone进inducible系统，基因太大
的可能会有时间上的延后。总体时间1个半月可能是比较保险的。
细胞系，如果我们inhouse已经有的，做完的价格大概在1500左右，只要mixture大概
1000-1200。
如果你的细胞比较特别，比如胚胎干细胞，价格会有不同。因为本来培养这类细胞的试
剂就比较贵，相信你也能理解吧:) |
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a*********n
发帖数: 2526 | 32 我指的是 cells stabling expressing tagged protein.
以前做过，挺麻烦，现在有没有新技术来作这个的？ |
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X***n
发帖数: 366 | 35 lentivirus with puromycin selection |
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g*********5
发帖数: 2533 | 36 which lentivector is good? |
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s******s
发帖数: 13035 | 37 gateway的lenti还带tag的，有什么就用什么呗，估计没太多选择 |
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h******u
发帖数: 602 | 39 原先实验室做了一单抗。偶前一阶段发现此抗体在免疫组化中特别好用，可以辅助诊断
某型白血病。
现在想把荧光物连到此单克隆抗体上用于ＦＬＯＷ ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ。虽然连接应
该不会太难，但对此方向一窍不通，平时也没时间，有没有公司专门给做这个的？谢谢
了！包子谢。。。 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 40 用lenti会比较好，因为lenti不是从单细胞来的，所以能排除单克隆基因型不稳定及目
的片段特异插入带来的问题。
基因比较大还是载体比较大？pc3.1大概5k,也就是说你的目的基因3k大，lenti还是放
得下的。如果是你的目的基因就7k，那就麻烦了
搞不好瞬转表达也有问题。 |
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m******t
发帖数: 187 | 42 诸位大侠，
本人现在生物博后，研究方向涉及病毒学、疫苗学、微生物学以及免疫学。目前从事的
研究工作是抗传染病媒介疫苗（HIV-1，Chagas disease）的研发，以及基于腺病毒载
体的抗肿瘤转基因疗法和神经方向的研究。过去从事的研究工作有单克隆抗体的开发及
应用；抗病毒小分子药物的筛选及抗病毒机理研究等。
目前我小有几篇文章，但review的文章只有一篇，觉着申请绿卡条件还不够充分。所以
，在此，真诚恳求有review以上研究方向的文章的机会。
有兴趣的大侠可以站内联系偶，或者我的email: m*********[email protected].大侠如若
需要偶的CV，我将第一时间奉上！
先在此谢过罗：） |
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m***y
发帖数: 627 | 43 感觉挺神奇，是否你的突变质粒不纯？你把初始vector自己转化下挑几个单克隆再测测
序吧。
然后再把测好突变的质粒再切连进新的vector里去再看看 |
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d****i
发帖数: 2346 | 44 很想用CRISPR，但是担心设计，合成，连接克隆，转染进去以后发现没作用，有off
target，折腾了好长时间拿不到phenotype。
问一下楼主，你做KO有没有筛单克隆？那个过程我感觉蛮复杂的。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 45 请教楼上高人，
1)利用几个大实验室的在线设计工具，设计三个gRNA，构成三个载体，转染细胞。假定
转染效率不是瓶颈，这个一般是不是直接做realtime或者western挑一个效果最好的就
用了？还要不要做off target检测？我担心的是三个里面还没一个效果满意的。
2)如果我跳过筛单克隆这一步，转染后加药稍微筛一下，然后直接进入下游实验。这个
情况下效率会比siRNA更好吗？
谢谢！ |
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s******s
发帖数: 13035 | 46 不知道这个东西。不过听上去，只要ips效率够高，不就是
经典的纱布印图章实验么。sort 10个384孔板单克隆，
长壮了，一分为三，一盘留种，两盘诱导。。。
） |
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T****u
发帖数: 424 | 47 自己做的。两天做好载体。一般一个半月拿到细胞。
挑单克隆 10%-20%的complete KO. |
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T****u
发帖数: 424 | 48 抗体不一样的是可变区。
除了有药物前景的，没人去测。
同一个蛋白的不同的单克隆可变区也不一样。
查查专利数据库，里面有PD1, EGFR humira等的抗体信息 |
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e******8
发帖数: 319 | 49 会真核原核蛋白表达系统，并会特有的三个月建立单克隆细胞株技术，会大部分化学合
成标记技术用于分子成像，免疫组化，治疗和诊断。生物技能扎实，会建各种原位模型
。 |
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s*********s
发帖数: 110 | 50 sina上有个comment
NIBS-王晓东实验室发现Necrosis的分子机制 此博文包含图片 (2014-04-12 14:
41:15)[编辑][删除]转载▼
NIBS-王晓东实验室发现Necrosis的分子机制
NIBS-王晓东实验室发现Necrosis的分子机制
在April 10发表的Molecular Cell杂志封面文章中，王晓东实验室描述了MLKL的磷酸化
是如何导致了细胞程序化坏死的分子机制。MLKL的磷酸化使其从单体状态向多聚体状态
的转化。多聚化的MLKL可以结合多种磷脂，从而由细胞质（弥散分布）转移到细胞膜和
细胞器膜上；并在这些膜结构中形成通透性孔道，从而破坏膜的完整性，引起细胞坏死
。这一点有点类似于细胞凋亡中的重要的蛋白Bax和Bak, 在细胞凋亡领域，Bax/Bak在
细胞凋亡过程在线粒体表面聚集，多聚之后形成孔道，从而释放细胞色素C(Cyto C),
诱导细胞凋亡小体，从而激活Caspase3,最后导致细胞凋亡。
这篇文章同时介绍了王晓东实验室还开发了(Epitomics公司)能特异识别人源p-MLKL磷
酸化的单克隆抗体，并证明这一磷酸... 阅读全帖 |
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