m******5
发帖数: 1383 | 1 求教：
我在做一个做knock in mice用的大质粒（12k)
单酶切后是一条12k的线性化的带
但切胶回收后跑胶，12k的带变淡，却出现两条很浓的9k和6k的带。
实验室同学怀疑是star activity,但鉴于我跑的是切胶回收后产物，我怀疑是长质粒自
身缠绕形成的结构，跑得比较快
请教大家遇到过这种情况么？（再次强调酶切后跑胶只有一条带，6k和9k的带是胶回收
后跑胶时出现的） |
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s*******e
发帖数: 1010 | 2 貌似单酶切链接总是反向连接产物多一些，似乎携带无意义编码的DNA的质粒总是比有
意义的具有生存优势。colony PCR几乎是必须的后续手段，酶切鉴定我一般都不做。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 3 前的状况是单酶切AGEI,用T4ligase过夜后转化
菌系试过DH5alpha和Top 10。
所有连接都是反向的。
目前的情况是质粒没法做任何改动，只能在insert上做手脚，但问题是不知道症结在哪
里从何改其 |
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d******u
发帖数: 99 | 4 老天。。我刚设计了一个引物，也是打算用Age1 单酶切去做，质粒也差不多13k。。。 |
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s*****g
发帖数: 87 | 5 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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s*****g
发帖数: 87 | 6 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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s*****g
发帖数: 87 | 7 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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m******5
发帖数: 1383 | 8 版上有前辈用AGEI这个酶做过单酶切么？
最近正在用它，出现大量tricky的情况，请问这个酶有什么忌讳么？
另外，网上也找不到它的保护碱基的设计信息 |
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m*********7
发帖数: 111 | 9 pBluescript SK+ 用BamHI 完全单酶切后,得到的线性DNA片断(约3.0kb，没有用去磷酸
酶处理)用Qiaquick PCR purification kit纯化，纯化后的线性DNA保存在水里，在没
有DNA ligase的情况下，该DNA片断稳定么?会不会自连成环呢?
请大拿们不吝赐教，3x in advance! |
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S******l
发帖数: 14311 | 10 用酶切buffer与loading buffer一起上样看看 |
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a****o
发帖数: 1786 | 11 你的产物的某一端如果正向连接可能形成Stem-Loop结构, 容易被细菌内的酶切开 |
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m******5
发帖数: 1383 | 12 18个酶切验证阳性的克隆
这个东西plasmid比较大（13k）不太好连，这18个是从200多个克隆里挑出来的…… |
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s******s
发帖数: 13035 | 13 设计PCR引物cover酶切点，然后colony PCR直接批一个96孔板的 |
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b**********8
发帖数: 349 | 14 我之前做TA的时候也遇到过这样的情况，我要的是反向链接的，不过连续挑了30几个都
是正向的。后来老板告诉我挑克隆的时候注意同时挑一些个头大的菌落和个头小的菌落
。我发现那些个头小的过夜摇菌的时候长的很差，不是那种均匀的浑浊，而是一团白色
的粘糊糊的附着在tip上，其实之前那30个里我也遇到过这样的，当时以为是污染了于
是把菌液丢掉了，没有抽提。最后那次把所有的菌液抽提，经酶切验证发现那些个头小
的摇菌后呈白色团块状的就是我要的。后来猜测估计反相连接的序列可能会在菌体内表
达某些有毒性的蛋白，所以不容易挑到。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 15 同事之前收到别人给寄过来的质粒，已经是大提好了的。送测序公司简单测了一个反应
，匹配。
后来同事基于这个质粒又构建了其他几个衍生，测序据说也都啥没问题。后来再做酶切
时，顺便点了个质粒对照，结果问题来了。
单酶切，双酶切，片段大小都正确。单单这个未酶切的质粒对照，不是正常超螺旋质粒
应有的迁移速率快于线形片段的情形，反而显示条带还显著大于单酶切后的线形片段。
（质粒大小6.5kb，正常的超螺旋结构约3.5-4kb,而该未切质粒显示8kb）
同事今天找我讨论，想了半天没法解释。从来没遇到这种情况，确切地说很少做质粒对
照，单双酶切正确就完了。没想到还有这种情况，怎么解释？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 16 现在在进行一个大载体（13k）单酶切连接大片段实验
因为遇到种种问题一直不奏效，所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
方法设想为：将大载体单酶切线性化后，用PCR引物把线性化的质粒p出来，期中一端引
物添加一个新酶，之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切，就形成了两个粘性末
端，于是就成为双酶切连接。
请问这样可行么? 另外 ，ＬＡ Ｔａｑ引入突变的几率大么
另外，补充问题，这么大的质粒用ｐｆｕ做定点突变靠谱么／ |
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a*q
发帖数: 2109 | 17 就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
了。
96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的
突破是SRS，08年发的。其实这已经不是CARS了，光谱有很大的不同。SRS看的是由于拉
曼散射造成一束激光的能量被转移到另一束激光，这需要检测到激光能量大概10^-7的
变化，但最终灵敏度比CARS高很多。用跟SRS同样的手段还可以对有吸收但是不发荧光
的东西成像（比方说血红素）。
在Harvard开始的方向是在单细胞+单分子水平上观察细菌基因的表达和调控，主要是分
析Transcription和Translati... 阅读全帖 |
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i****g
发帖数: 3896 | 18 介绍的很全面，谢涵盖的方向还真广。他最突出的贡献还是发明CARS和SRS吧？
就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
了。
96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的
突破是SRS，08年发的。其实这已经不是CARS了，光谱有很大的不同。SRS看的是由于拉
曼散射造成一束激光的能量被转移到另一束激光，这需要检测到激光能量大概10^-7的
变化，但最终灵敏度比CARS高很多。用跟SRS同样的手段还可以对有吸收但是不发荧光
的东西成像（比方说血红素）。
在Harvard开始的方向是在单细胞+单分子水平上观察... 阅读全帖 |
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a*q
发帖数: 2109 | 19 就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
了。
96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的
突破是SRS，08年发的。其实这已经不是CARS了，光谱有很大的不同。SRS看的是由于拉
曼散射造成一束激光的能量被转移到另一束激光，这需要检测到激光能量的微小
变化，但最终灵敏度比CARS高很多。用跟SRS同样的手段还可以对有吸收但是不发荧光
的东西成像（比方说血红素）。
在Harvard开始的方向是在单细胞+单分子水平上观察细菌基因的表达和调控，主要是分
析Transcription和Translation的随机... 阅读全帖 |
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i****g
发帖数: 3896 | 20 介绍的很全面，谢涵盖的方向还真广。他最突出的贡献还是发明CARS和SRS吧？
就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
了。
96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的
突破是SRS，08年发的。其实这已经不是CARS了，光谱有很大的不同。SRS看的是由于拉
曼散射造成一束激光的能量被转移到另一束激光，这需要检测到激光能量大概10^-7的
变化，但最终灵敏度比CARS高很多。用跟SRS同样的手段还可以对有吸收但是不发荧光
的东西成像（比方说血红素）。
在Harvard开始的方向是在单细胞+单分子水平上观察... 阅读全帖 |
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x******o
发帖数: 76 | 21 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。 |
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r****r
发帖数: 379 | 22 一般大片段克隆，会导致连接效率很低，克隆数大大减少，可以看看你的克隆数和你常做的克隆比是不是还比较正常，如果比较正常，那说明这种假阳性很可能是因为你的插入片段有一段序列比较容易发生重组，试着30度长克隆和摇菌看看。另外，能不用单酶切做克隆就不要用，你大片段克隆还用这个策略，最好换其它双酶切。
另外，单就大片段克隆而言，建议用GeneHogs菌株，我手上的片段普遍10k以上，用这个菌株，从来没出现过问题，感受态效率一般7次方就可以了，15kb可以长百来个克隆。
因此建议先更换单酶切策略和换genehogs，然后不行再换30度生长看。30度生长，已发生重组的质粒，一般10个有2个总是对的。
gone
cut |
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n****0
发帖数: 696 | 23 如图，lane1是marker，lane 2 3 6 7 是单酶切，lane 4 8 是双酶切，lane 5 9是没
有酶切的对照。我提了两个质粒，是一样的。
另外我的其中一个单酶切好像不完全，也有一个很大的带。难道我的质粒结合了什么别
的东西？
smear |
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b******n
发帖数: 4225 | 24 NEB的好处是ligase可以在限制性内切酶的buffer中工作
对于一些tricky的克隆非常好用
比如说防止平末端单酶切自连可以加对应酶已减少背景自连
Promega的酶挺稳定的
咱们实验室03年的酶还能work
主要不爽的是T4 DNA ligase的buffer跟RE的buffer不兼容
另外Promega有30种酶经过测试1ul可以在五分钟内酶切完全1ug质粒DNA
这种高效性还是比较靠谱的
NEB的RE没有这方面的数据，心里没底 |
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x*r
发帖数: 11073 | 25 我今天比较忙，刚才抽空打电话问了问LD,他大概说了几点，如果你还需要讨论的话，
晚上可以电话:))
1，Colony PCR 不是很可靠，cycle 数目不可多，要少，最好是控制在25个cycle以下。
2，单酶切连接最好用CIP.
3,制备片段的时候，做酶切的酶是不是同尾酶？
4，Promega的连接酶比invitrogen的要好用。
5，连接片断是通过PCR还是通过酶切拿到的？PCR产物的话，确定有粘性末端吗？
新的 |
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d*****r
发帖数: 2583 | 26 ☆─────────────────────────────────────☆
Genemo (猜猜) 于 (Tue Feb 17 12:37:29 2009) 提到:
整个目标是把2个3.4kb的片段连在一个8kb的载体上
现在第一个已经连上去 是双酶切的
第二个怎么也连不上去了
这个是单酶切 为了避免过多污染 我直接PCR产物酶切 酶切位点旁边留了4个碱基给酶
bind
虽然PCR的模板是质粒 但我做了割胶回收
现在insert自连很多 和正常的连接差不多 很奇怪为什么自连了还能有抗性呢
这个问题不知道有么有高人见过而且解决过？
还有就是现在这个载体太大了 怎么才能提高连接效率呢
☆─────────────────────────────────────☆
albertsmwk (Stay in Bio) 于 (Tue Feb 17 12:52:48 2009) 提到:
载体用SAP处理，过夜酶切，过夜SAP，基本可以做到没有自连
insert自连。。。。你为啥知道啊？！难不成跑胶测序？
不行用takara的long ligase kit，做10K肯定没问题 |
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z*t
发帖数: 863 | 27 单酶切条件下insert磷酸化+vector去磷酸化能把自连降到多少？
现在想把一个cDNA subclone into another vector,但目的vector只有两个酶BamHI和
MluI可以切，并且BamHI还会在cDNA内部有一个切点。。。除了单酶切，我还有什么办
法么？ |
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x**y
发帖数: 147 | 28 首先感谢您进来.
如果您是做
1)甲烷单加氧酶
或者
2) 含铁模拟酶催化
或者
3) heme或non-heme iron-oxo enzyme
研究方面的,能否留下您的足迹或者或联系方式,我想和您请教一下这方面的基础(非常
基础)问题.
先谢谢! |
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y*h
发帖数: 25423 | 29 口服够呛，酶是蛋白质，一般的酶喝下去就被消化了…… |
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n****0
发帖数: 696 | 30 为什么单酶切产物比未酶切的质粒对照跑的快呢？双酶切倒是得到了想要的大小的产物
。谢谢。 |
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b*******l
发帖数: 80 | 31 在想日后的科研方向，想用单分子力学技术研究酶蛋白,在分子层面上理解酶催化。因
为背景不是生物，想找一本比较全面又涵盖最新研究进展的书看一下。请问大家有没有
推荐的？多谢了。 |
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w*********g
发帖数: 30882 | 32 我国首个单次推注溶栓新药诞生 打通梗塞心血管一针救命
来源: xwu622 于 2015-02-16 15:06:03 [档案] [博客] [旧帖] [给我悄悄话] 本文已
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我国首个单次推注溶栓新药诞生 打通梗塞心血管一针救命
来源：中国科技网-科技日报 作者：左朝胜 2015年02月16日 00:27
科技日报讯（记者 左朝胜）突发心肌梗死的病人，及时在静脉推注一支药剂，就能神
奇地打通梗塞的心血管，一针救命。这支神奇的药剂就是广州铭康生物工程有限公司历
时15年研究开发的溶血栓新药铭复乐。今年以001号获得了新药证书和批准文号，通过
GMP认证，成为国内首家获批上市的第三代重组t-PA，拥有4项国家发明专利。
国内外溶栓药物的发展经历了三代产品。链激酶（SK）和尿激酶（UK）是国内外使用较
多的第一代溶栓药，其价格便宜，但引起机体出血几率较高，尤其是颅内出血的危险很
大。第二代溶栓药以组织型纤溶酶原激活物（t-PA）为代表，其对血栓部位有一定... 阅读全帖 |
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b****r
发帖数: 17995 | 33 今天从这个中国公司收到的广告邮件。不知道效果到底如何，这个看起来不比nanopore
差啊，而且都已经在商业公司卖了。。。
http://www.bio-star.cn/contents/239/225.html#ly
Irys单分子基因组结构成像系统
剥茧抽丝，让让基因组纤毫毕现
Irys系统特征
长链DNA分子
DNA分子可长达几百kb，完全可以跨越重复单元和可变区。
高质量的数据
单分子DNA通过纳米通道被拉直，平行排列，生成高质量的图像，基因组结构展现无遗
应用灵活
Irys系统可以作为一个开放的平台为研究人员提供多种形式的遗传分析
让我们组织，而不是堆砌数据
在过去的几年里，二代测序的高通量一直主导着基因组研究的发展。
但是二代测序技术可以廉价的获得大量的测序数据，但是受制于较短的读长，这使得科
学家们无法简单而直观地看到整个基因组范围的结构变化。现在，针对更长片段的分析
方法对于基因组结构研究显得越来越重要。另外，由于基因组的复杂性，诸如重复序列
和结构变异，限制了基因组的重构和对功能元件的理解。Irys系统克服了这些困难，利
用一种新的方法去获取单分子，尤其是长链DNA分... 阅读全帖 |
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w***u
发帖数: 17713 | 34 这些酶进了人的消化道不就绝大部分被消化掉了吗？ |
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w***u
发帖数: 17713 | 35 在肝脏合成，分解的是血液的酒精，而且乙醇脱氢酶的最适作用pH值在7.0-10.0。要口
服的话，是个大项目。 |
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i**b
发帖数: 918 | 38 性激素这种steroid型激素当然可以这么做……这么大一个酶皮肤怎么吸收…… |
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w***u
发帖数: 17713 | 39 经皮或粘膜吸收的主要是小分子，最多也就不大不小的分子，那么大颗的酶，不容易啊
。 |
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i**b
发帖数: 918 | 40 endothelial cell怎么吸收这么大的酶……endocytosis么……这个效率……也太低了
点吧…… |
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f**k
发帖数: 15238 | 41 还是得注射
而且即便做成液体的针剂也不好保持活性.
这东西是酶,遇光遇热的谁知道变成什么了 |
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i**b
发帖数: 918 | 42 no way.
关键不是吸收速度的问题……是吸收效率的问题。
endocytosis吸收那么大的一个酶是相当的不靠谱的事情。 |
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b******r
发帖数: 111 | 43 Good idea. My 9kb DNA itself contains too many restriction sites. NotI is
the only choice.
'Description:
Important: GeneHogs® competent cells are being discontinued on December
31, 2007.
Use ElectroMAX™ DH10B™ T1R cells for exceptional performance!
'
常做的克隆比是不是还比较正常，如
果比较正常，那说明这种假阳性很可能是因为你的插入片段有一段序列比较容易发生重
组，试着30度长克隆和摇菌看看。
另外，能不用单酶切做克隆就不要用，你大片段克隆还用这个策略，最好换其它双酶切。
这个菌株，从来没出现过问题，感
受态效率一般7次方就可以了，15kb可以长百来个克隆。
发生重组的质粒，一般10个有2个
总是对的。 |
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H****s
发帖数: 301 | 44 有两个建议：
（1）改双酶切连接为单酶切连接。载体要处理好。
（2）使用DH10B感受态。或者是类似的RecA-菌。
我做的插11kb到5kb的载体上去，基本上都成了。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 45 你的意思是，双酶切载体和插入片段，互补端对T4活性有影响？
不过我以前做单酶切然后去磷酸化，结果无数自连没一个连进去了的，这个怎么搞呢 |
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z*******o
发帖数: 1794 | 46 在单酶切，并且是vector不去磷酸化的情况下，多加PCR产物肯定没有问题。但这样的
条件谁也不会去做连接，vector自连的风险太高了，就算运气好进去了还有一个正反的
问题。如果是两个酶totally digested呢？原则上说vector将不会存在自我连接的风险
，同时这样的连接无论vector还是insert都是定向的高效连接。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 47 呵呵，那可以这样，先BamHI单酶切连接PCR产物的一部分
（外面的BamHI位点设计成BglII）
然后再MluI和BamHI双酶切连接PCR产物的另外一部分
PCR产物 MluI-BamHI-BglII
先克隆BamHI-BglII片段进入BamHI消化的载体
得到正确克隆之后再克隆MluI-BamHI进去
这个缺点就是没法转移到另外一个载体上去了 |
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a******p
发帖数: 414 | 48 17k还用酶切，还是单酶切？ 真牛呀。 用重组吧 |
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b******s
发帖数: 1089 | 49 实验室其他人遇到过经年的KpnI不work。但我自己切没遇到过问题。单酶切你可以上很
浓的质粒，多加点酶，但是不要超过反应体系的10%，过夜，加CIP，应该能做出来。
fragments
ligation |
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w*e
发帖数: 740 | 50 未酶切的因为是环状，所以没直线的单酶切跑的快，和结构有关吧 |
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