s***e
发帖数: 911 | 1 不太可能. 单分子unzip DNA hairpin的测量里, DNA一般比100 bp还短. normal
experimental condition下需要> 10pN才能把双链分开. |
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F******p
发帖数: 2099 | 2 Gel red能整合进双链，为什么不致癌？能说说吗？ |
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k********u
发帖数: 2209 | 4 那前面的很多N的序列，如果你仔细看序列原文件上面的图谱，其实还是能读出来
很多的。既然你是测双链的，正义的前面读不出来的部分，反义的后面还是读得出来的。
偷懒的人，就可以这样对付过去了。
当然，要求高的人，一般是根据你反义链后面读出来的序列，设计反向引物，比你的
序列开始的地方提前150bp左右比较保险，从新设计引物再测，很多测序的地方都提供
这个服务的，多收10刀设计费用一个引物罢了。 |
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K**********e
发帖数: 188 | 5 谢谢上面的和sunnyday。
1 哦哦。那还好，细胞培养基有点黄，但还是有点红。因为是悬浮细胞，稀释可以吗，
还是最好离心下来再用新鲜的培养基悬浮？
2 嗯嗯，原来载体拿限制内切酶切了的话就上带有磷酸基了啊。我没有用磷酸酶处理载
体。我合成的时候没有要求，就是当成引物让公司直接合成的。那我用T 4 PNK kinase
又处理了我的要插入载体的双链DNA片段，是不是就多了一个磷酸，反而连接不上去了呢？
可是指导我做实验的senior postdoc让我用T4 PNK处理，他也知道我是公司直接合成的
引物。这个postdoc以前做过很多这样的载体，应该很清楚呀。
其实我做的是合成hairpin DNA，克隆进载体，准备做sh RNA knock down。 |
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p****p
发帖数: 3360 | 6 有意思。不过cDNA应该是RNA－DNA hybrid双链或者cDNA单链，应该用什么ligase？ |
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p****p
发帖数: 3360 | 7 有意思。不过cDNA应该是RNA－DNA hybrid双链或者cDNA单链，应该用什么ligase？ |
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p*****m
发帖数: 7030 | 8 这玩意谁知道啊 呵呵 实际上cut DNA双链 然后往里面加减东西照样也要消耗很多能量
但是大部分细胞都能做
不要那么保守 呵呵
to |
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 你说的太笼统了
一般我们说“酶切”不加别的限定的时候大家第一反应都是“DNA双链限制性内切酶”
蛋白水解酶不是我研究的东西，所以我也就是瞎说哈：
看样子你的意思是说你们做一个试剂盒检测待测样品中是否含有某一种蛋白水解酶
血浆里面是不是有不止一种可以作用于你的底物上的蛋白水解酶呢？
如果是的话你要弄清楚到底有哪些可能遇到的别的蛋白水解酶
它们在你用的底物上酶切位点以及识别位点是什么
跟你这个试剂盒针对的酶的酶切位点以及识别位点有什么区别
然后在根据这样的综合信息来决定底物肽链上哪些氨基酸需要修饰 |
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y******y
发帖数: 107 | 10 就是一个单链的plasmid，请问什么酶可以切除，而不能切双链的plasmid。
Mung Bean Nuclease？
T4 DNA polymerase？
谢谢。 |
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S*******m
发帖数: 34 | 11 有一个事情没注意到.如果你的cDNA已经在载体上说明已经是双链了.镁离子应该同普通
PCR一样,用
1.5. 3mM是用于扩增作完RT之后的单链cDNA的. |
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s********2
发帖数: 138 | 12 嗯,oldmonster 批评的是，我总觉得自己现在的表达水平骤降。我用的是BigDye
teminator cycle sequencing kit进行测序。试剂盒里面自带一个质粒和引物，作为
control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所以用量大）。我用
的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也是1.7-2.0。产物
和引物的比例是50ng：3.2pmol。进行cycle 标记，进行了25个循环。然后将标记后的
产物用Ethanol/EDTA 进行纯化。结果是：control出来结果很好，而自己的产物却只有
在很前面的地方有很高的几个峰，根本不是产物。所以我怀疑我的产物根本没有标记上
？不知道这样是不是还是不够详细。希望大家能够帮帮我！ |
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s********2
发帖数: 138 | 13 这个就是我得到的两个结果。sample就是自己的样品，另外一个是control。希望大家
能够帮帮我！谢谢了。
质粒和引物，作为control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所
以用量大）。我用的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也
是1.7-2.0。产物
产物纯化试剂盒，利用了专门用于测序的那种纯化试剂盒。第二，我尝试着用了DNA浓
度梯度。但是出来的结果都是一样的。只是在最前面有几个峰。我真是不知道到底是哪
里出问题了。希望大家能够帮我分析一下。 |
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k*******s
发帖数: 214 | 14 这是sequencing PCR reaction根本没有开始，有几个可能
1. 你的引物的Tm太低，在同样退火温度下，引物没有结合好。
2. 模板的溶度太低。
3. 模板样品里面有抑制PCR反应的物质，比如EDTA
另外BigDye很稳定，自带的对照肯定能做出来，因为样品最纯的，引物M13也是最常用
的，本身做这个对照没有意义。
质粒和引物，作为control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所
以用量大）。我用的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也
是1.7-2.0。产物
产物纯化试剂盒，利用了专门用于测序的那种纯化试剂盒。第二，我尝试着用了DNA浓
度梯度。但是出来的结果都是一样的。只是在最前面有几个峰。我真是不知道到底是哪
里出问题了。希望大家能够帮我分析一下。注： 后面有结果图片。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 15 有，叫splinted ligation。
因为T4 DNA ligase的功能是特异性修复双链DNA上的nick。所以需要设计一个splint
oligo，和你需要ligate的两个oligo的两端各自互补。像这样：
图里显示的是连接RNA，不过DNA也是一样的。
这个protocol在这里：
http://www.megaupload.com/?d=QT50D23R
[7] Joining of RNAs by splinted ligation
Melissa J. Moore and Charles C. Query
Methods in Enzymology
Volume 317, 2000, Pages 109-123
RNA - Ligand Interactions, Part A |
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o**4
发帖数: 35028 | 16 那我就从基因组上enhancer的两边多扩增一些出来就行了吧？
比如100bp怎么样？
另外，使用单链DNA做pull down好？还是应该用双链呢？
O(∩_∩)O谢谢 |
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o**4
发帖数: 35028 | 17 那还是用双链？这个更加接近in vivo吧
“越长未必越好”，怎么说啊？
吧。 |
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a*****a
发帖数: 32 | 18 看到文献说先将DNA和98%Formamide或者0.1M的NaOH 1:1 混合，然后95度30分钟，然后
跑6M的Urea Gel就能分开两条互补链，但是实际上不行，如果加热95度30分钟，
会导致跑胶出现N条带(N>6, 可能是因为Tm值介于75-80，过高，导致部分aneal)；
如果不加热的话，aneal在一起的双链DNA (一条30bp，一条40bp) 的band又占了主要。
有没有哪位高人知道如何能将两条互补的DNA链跑出单链的band出来？
万分感谢！ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 19 可以用PCR仪来加热，但是不应该用PCR仪来冷却。那个降温速度太慢了，还是会有部分
双链anneal上的。而且30分钟太长了，你只有30bp的互补区，加热5分钟基本就够了。
如果你用PCR仪加热，设定95度大于5分钟，六七分钟或者更长都行，等样品加热满了5
分钟之后，立即取出管子放到冰上，这样才叫snap cool。 |
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a*****a
发帖数: 32 | 20 谢谢大家的指点，根据楼上各位的办法我都试了试，都挺好用的。非常感谢！
发信人: wangbin (wangbin), 信区: Biology
应该挺简单的,照这个配下buffer https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/
US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603425 sample 95度3-5分钟，不用30分钟,
那是给大片段用的,200以下SSR之类的5分钟就够了,时间太长了引起降解(大片段掉俩bp看不
出来),确实会出N条带，冰上放一会儿(把泳道吹干净了),尥蹶子跑吧.然后染色,切胶回收，
（一条30bp，一条40bp是很大的差异了，一般差2bp就可以保证质量了）。
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发信人: ThisjobIwant (这活我来干), 信区: Biology
可以用PCR仪来加热，但是不应该用PCR仪来冷却。那个降温速度太慢了，还是会有部分
双链anneal上的。而且30分钟太... 阅读全帖 |
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p***n
发帖数: 9 | 21 实验中遇到一个问题，亟待解决，请各位高人支支招！
我们借助一个蛋白质将双链DNA与树脂相偶联（蛋白质与树脂之间是非共价结合），但是自由状态的DNA会与树脂发生非特异性结合，请问：如何在保持蛋白质活性的情况下，将非特异性结合的DNA从树脂上去除？
非常感谢！ |
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W****C
发帖数: 1937 | 22
我觉得也是这个问题， 37度的时候还是容易开吧。
我猜用两对引物的就是合成的两个PCR产物一个3端多几个cg。。一个5几个gc， 然后高
温melt， 低温aneal， 产生部分3,5两端有CG overhang的双链， 再连到载体上。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 23 我倒是想知道，没有对细菌和病毒的认识，单链双链逆转录病毒，没有cd4 cd8 etc，
没有对多肽和抗原抗体的认识，疫苗是怎么大规模产业化的。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 24 1. 可以跑胶看size吧，DNA ladder是双链的。看你的sample跑得位置和ladder是否一
致。不过如果你的DNA片段太小可能不容易判断。
2. 我觉得重新anneal就好了吧，除非你的ssDNA本身有复杂的二级结构，否则加热退火
之后anneal成dsDNA应该问题不大。重做PCR感觉很多此一举似的。不过我也没有做过类
似的sample处理，不知道实际做起来会不会是影响很大。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 25 没做过酶切回收测序，因为除非特殊情况（比如长重复序列）基本上没有这个需要。但
是PCR产物回收测序算是routine这没有什么疑问吧。你们测序中心给出的解释，类比一
下，个人觉得很牵强。我专门打电话给测序公司的技术支持，人家说没有任何问题，而
且常用的qiagen等胶回收试剂盒的说明上也写得很清楚，回收后的片断可直接用于测序
反应（参考试剂盒说明或主业）。
1. 胶回收自然会影响得率，一般损失在50%以上，但是只要你能保证回收后测序模板的
浓度（一般而言20-30ng/ul足够了），就没有问题，这应该是不难办到的。大不了酶切
体系做大一点，质粒多用一点而已。
2. 胶回收过程中DNA的变性复性没有那么夸张，如果是单链DNA有可能形成不规则结构
，双链除非特殊情况，还是很稳定的，你的酶切产物和一般的PCR产物没有本质的不同
，测序上自然也没有明显的差异。建议你问问他们是不是PCR产物胶回收测序也不能做
，如果是这样的话，那就没什么可说的了，建议你送公司测序吧，你们的测序中心不靠
谱。
不知道你们那里是什么情况，反正我们这里的测序中心就是垃圾。硬件倒是很好，2台
454，2台GA，还有好几... 阅读全帖 |
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m****M
发帖数: 360 | 26 有哪位做过抗体和DNA conjugate的？crosslinker是什么？最多能连多长的DNA/oligo/
primer （i.e.双链,单链都可以）。连后是怎么分离没有连上的DNA，要保持抗体仍然
具有结合抗原的能力。非常感谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 27 会。
至少有两个可能性：
1。完整的双链环状质粒是很稳定的，但是大质粒在提取的时候容易受损，
可能会在其中一条链上有缺口什么的，放在水中就慢慢会被降解。
2。提取的时候蛋白没有去干净，可能有少量核酸酶残留。特别是如果最后的
溶液里没有加EDTA的话就很容易被降解。 |
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A****A
发帖数: 16 | 28 利用ZFN等reagents做Knock in应该是一些lab目前的奋斗方向。ZFN可以产生sequence
specific DNA double strand break. DNA双链断裂可以有效的提高homologous
recombination的频率，从而达到Knock in的目的。目前，在fish里面实现高效的HR还
很困难，即使在有ZFN的帮助下。我不是做fish的，主要做DNA repair pathway. 我觉
得可以通过一些genetic或chemical的手段抑制fish的NHEJ pathway，来增加HR的频率。
model
transpare
rep
to
很多
serious的
大好 |
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b****r
发帖数: 17995 | 30 楼主既然提到这些蛋白，想必故事了然于心，不拿出来分享一下就有点不地道了
我觉得还不太清楚的几个关键分子/pathway，一个是控制器官大小和形状的（当然最近Hippo还是做
出来了一些东西），一个是双链染色体怎么在分裂的时候配对和同源重组。
neuroscience方面就更多了，什么东西控制人的性格，人的智力等等 |
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b****r
发帖数: 17995 | 31 楼主既然提到这些蛋白，想必故事了然于心，不拿出来分享一下就有点不地道了
我觉得还不太清楚的几个关键分子/pathway，一个是控制器官大小和形状的（当然最近Hippo还是做
出来了一些东西），一个是双链染色体怎么在分裂的时候配对和同源重组。
neuroscience方面就更多了，什么东西控制人的性格，人的智力等等 |
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a******p
发帖数: 414 | 32 肿瘤组织和受损失的liver都会分泌microRNA到血液中，这已经有报道了， 其他组织摄
取miRNA的报道我没有看到，一个重要的问题是，这种miRNA是单链还是双链，ambion的
technian说单链的miRNA很难整合到RISC上，还有miRNA的浓度有多高， 能不能高到一
个能够抑制其他细胞的target gene， 个人觉得这个一个新发现，但是没有多少的临床
的意义，因为注射的方式oligo应该比口服更见有效 |
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a******p
发帖数: 414 | 33 肿瘤组织和受损失的liver都会分泌microRNA到血液中，这已经有报道了， 其他组织摄
取miRNA的报道我没有看到，一个重要的问题是，这种miRNA是单链还是双链，ambion的
technian说单链的miRNA很难整合到RISC上，还有miRNA的浓度有多高， 能不能高到一
个能够抑制其他细胞的target gene， 个人觉得这个一个新发现，但是没有多少的临床
的意义，因为注射的方式oligo应该比口服更见有效 |
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O******e
发帖数: 4845 | 34 公司一般都是直接卖给你成品－－双链。1800人民币大概280美元了，如果是5nmol
的剂量，这个价格就太贵了。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 35 有一个很变态的方法，如果你一直要做这样的检测可能有用，
否则你就deep seq吧
这个方法类似的去年好像有一个检查癌症单碱基突变的nature还是
science文章有，为你的改编一下大概是这样：首先PCR把你要的这段
P出来(cycle不要太多), 然后加热退火杂交，因为你的突变型很少，
所以大多数是完美双链，小部分是有一个mismatch的dsDNA. 这个东西
克隆到特定的载体里面，转化有识别mismatch的ecoli. 有mismatch的
就切开修了，顺便把载体里面下游的一个特定结构（比如loop)的致死
或者抗药基因也修掉了；否则不开修，这个转化子活不了。这样，你
spike几个不同比例的control，用转化colony多少做标准曲线就可以估计了 |
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s******s
发帖数: 13035 | 36 有一个很变态的方法，如果你一直要做这样的检测可能有用，
否则你就deep seq吧
这个方法类似的去年好像有一个检查癌症单碱基突变的nature还是
science文章有，为你的改编一下大概是这样：首先PCR把你要的这段
P出来(cycle不要太多), 然后加热退火杂交，因为你的突变型很少，
所以大多数是完美双链，小部分是有一个mismatch的dsDNA. 这个东西
克隆到特定的载体里面，转化有识别mismatch的ecoli. 有mismatch的
就切开修了，顺便把载体里面下游的一个特定结构（比如loop)的致死
或者抗药基因也修掉了；否则不开修，这个转化子活不了。这样，你
spike几个不同比例的control，用转化colony多少做标准曲线就可以估计了 |
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k*******3
发帖数: 1909 | 37 我指的是测genome的DNA啊， DNA不是双链吗？ 我想知道出来的read的哪条链的。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 38 你们都没有好好读文章
它说了，不用denature，就是直接读双链DNA |
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m***T
发帖数: 11058 | 39 非常好的讨论，学习了。对于双链的DNA，它似乎是用hairpin的方式来读取的。
它的优势大家已经讨论过了，从一个竞争者的角度来看，我来提点它存在的问题（至少
从目前看）。
1、对于一个今年下半年就要上市的产品，到现在都没有真正的data出来供大家参考。
它present的data太小，能不能scalable，如何能做到scalable后保持相同甚至更高的
accurate rate，是它要面临的一个大问题。
2、用protein做介质，稳定性能否保证。看介绍它们只能保证6个小时，临界情况下的
data quality如何，这个还得等到有了具体的data才能知道。
3、它依赖于长而完整的DNA来有效测量，那么对于一些短的sequences诸如short
amplicons及FFPE等临床样本则基本上没有用武之地。不知道这个是不是它的一个短板？
还有些其它的，但觉得这几点最重要。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 40 现代化的分子克隆方法介绍
1. Gateway系统
这个很多lab在用了，swap不同的domain非常方便，适用于加不同tag,
用不同promoter，换不同的plasmid，好处是快速方便，不用考虑reading frame
2. Gibson Assembly
两条双链DNA，只要有20－30bp的overlap, 加点NEB的master mix，就能变成一条。
3. IDT的Gblock
500bp合成只要$99，配合Gibson assembly对付小片段克隆无敌，对付大片段可以
部分pcr，部分gblock(比如tag的部分) |
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d******1
发帖数: 709 | 41 关键是单链抗体，通常的双链抗体有问题，具体的忘了，有知道的人解释一下？没有驼
羊，找骆驼，或者鲨鱼也行。 |
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c*********7
发帖数: 148 | 42 nano body只有双链Fab的四分之一，应该是更specific一点，他们用的是heavy chain
，因为抗体对抗原主要是V heavy chain，加个light chain会有可能锚定不同state的
beta AR，至于为什么非要用驼羊就不知道了。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 44 直接order IDT的RNA oligo不行。
但是IDT的网站看上面的pull down list，有一项是gene silencing。那个是专门的
RNAi oligos。有predesign的，也可以customize。 |
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C********4
发帖数: 308 | 48 我有一个酶，切一段双链DNA出来，最后得到的是5端缩进去三个碱基。希望把这个缩进
去的补回来，最好还能伸出去一些碱基。
能否清楚的说一下，到底怎么做？
非常感谢！ |
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j****x
发帖数: 1704 | 49 对病毒的起源和进化没什么整体上的认识，直觉上讲两者各有利弊，在自然选择中进化
出和宿主相互作用的机制来看，两者基本共通，起源上应该有重叠。
RNA病毒不管+-还是双链对天然免疫的逃逸是其立足之本。方式之一是编码dsRNA
binding protein，包裹起来免于被识别，比如流感病毒。二是直接作用于天然免疫信
号通路中的重要蛋白，比如HCV。最极端的自然是HIV，免疫系统直接被crash了 |
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c******a
发帖数: 267 | 50 Antiviral Innate immunity 的最新进展
最近看到science上面有个innate immunity的牛人连灌两篇，心里很是xmjdh,于是决定
写点自己的浅见来表示对这个领域的大牛的仰慕之情。
就先从这两篇science说起吧。确实这是该领域的突破性进展，发S也是当之无愧。一篇
文章阐述了对于DNA virus 引起的antiviral interferin response的全新机理。以前
该领域一直致力寻找直接结合双链DNA的受体，也找到了好几个，但是在KO小鼠上面表
型并不十分明显。
而Dallas的james chen领导的小组发现DNA virus or ds DNA经常在细胞里诱导核苷酸
的转化，其产物cGAMP则能够直接激活下游的interferin responses. 所以这个cGAMP
就是在这个天然免疫反应里面一个secondary messager。当病毒或者细菌DNA进入细胞
被降解转换的时候，cGAMP 的产生能激活抗病毒免疫反应来诱导干扰素反应和阻止病毒
或者细菌的复制。
那么，自然这个负责转化病毒或者细菌DNA产生第二信使产物的... 阅读全帖 |
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