t*****z
发帖数: 1598 | 1 本人正在用一组带有很多含糊的位点的引物做PCR，
比方说：CGRTCAKGATCGWCSATAGC
我也不知道怎么称呼，是“degenerate primer”吗？
我想，在PCR反应体系中，其实只有一小部分引物真正与我的模板相结合，
比如我的引物是：CGRTCAKGATCGWCSATAGC
我的模板序列是：CGATCAGGATCGACGATAGC
里面有四个位点是简并的，所以在引物溶液当中真正与模板完全匹配的引物分子不过是
总分子个数的16分之一。
虽说别的不完全匹配的引物分子也或多或少能够结合，但是总体说来，简并引物的结合
效率要低于正常引物吧。
所以我想，要用简并引物做好PCR，是否需要加多于正常量的引物，以保证溶液中匹配
的分子个数达到正常水平呢？
我在摸索PCR条件。本来引物浓度通常不会当做需要优化的条件之一的，但是现在我打
这方面主意了。
以上是我的猜测，不知真实情况怎么样？请有经验的前辈们指点！多谢大家，新年实验
顺利！ |
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c***d
发帖数: 142 | 2 设计了一对用于long PCR的引物
F引物:
5'- CTC GGC AAA CAY AAA CTC CGC CTG TTT ACC AAA AAC -3'
GC content (%): 44.44 to 47.22; Tm (degrees C): 73.39 to 74.96
R引物:
5'- C AAC GAT AGT TTT TCA AGT TRT TRG TCT TGG -3'
GC content (%): 31.25 to 37.50; Tm (degrees C): 65.40 to 69.16
两个引物的GC含量相差太大，Tm值也差一些。看网上说GC含量相差太大的话，扩增不容
易启动。F引物已和别的试过，很好。R引物前后几个碱基都不适合加进去来改进引物，
别的位置也没法设计引物。所以我在5'端随机加了几个G和C以提高GC含量和Tm温度，如
下：
R引物（前面加了几个G和C，不和模版match）:
5'- gcg gcC AAC GAT AGT TTT TCA AGT TRT TRG TCT TGG -3'
GC content (%): 41.67 t... 阅读全帖 |
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n****3
发帖数: 543 | 3 刚收到那家公司的回复， The sales price of the machine is $48,500. The cost
of per-base is $0.07 for 50-mer long and 25 oligos per run. 并没有节省多少
花费。 我所了解的引物价格， 最便宜的是Eurofins MWG Operon: plate oligo，$
0.07/base, 但交货晚4－5天，在时间上没法与同行竞争。
看来二手的常规合成仪靠谱，谢谢楼上的链接，
还有一个问题，如果买个二手合成仪，自己动手合成引物，引物成本大约是多少钱一个
碱基？ 试剂据说也很贵，
如果大家知道还有更便宜的引物合成公司，周期也短，请推介一下。谢谢 |
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L****e
发帖数: 499 | 4 自己能设计，但是就是不太自信自己设计的。最近特地比较了一下从两篇不同的文章上
copy 的用于同一个基因的QPCR引物，这一做吓一跳，结果完全不一样，其中一对还是
一中国大陆的 cell metabolism文章上的引物，太坑爹了。刚才顺便看了一下bioRad
上的QPCR引物，价格简直吓死人啊 200 reactions 要$120,1000 reactions HPLC 要$
1000,这谁买得起啊。
请问一下大家做QPCR引物都是自己设计还是参考别人的文章，还是直接从公司买啊？ |
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e*******e
发帖数: 342 | 5 最近用quick-change的方法构建library，测序后发现在靶向的位点都有突变，但是在
该位点后面都有多出来的引物重复序列。
我所使用的方法及引物的设计是按照Stratagene的QuickChange Site-directed
mutagenesis kit来做的，用的序列完全匹配的一对引物，突变位点在引物的中间。本
来用的是Phusion，后来换成Pfu，结果一样。
不知道有没有这方面的高手，可以分享一下经验。
谢谢！ |
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L******e
发帖数: 679 | 6 最近PCR碰到一个奇怪问题。需要从人的genomic DNA 里PCR一个100到150bp左右的片段
（EGFR）。在第一个exon之前的intron里，设计了好几次引物，还是用PCR-BLAST设计
的。结果每次都出来一个1000bp左右的片段，测序后根本不是我要的那个基因来的（
EGFR）。最离谱的是在这里面（新基因全部的基因序列）尽然找不到我的PCR引物序列
。所用工具为BLAST。用BLAST检查引物又都对。
大家碰到过这种问题吗？劳驾给点建议。谢了。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 7 “最离谱的是在这里面（新基因全部的基因序列）尽然找不到我的PCR引物序列”
你看看两端跟你的引物有没有部分相似性
其实PCR引物如果3'末端有13个左右碱基相同就有可能P出来的（Tm值不够高的话）
另外你使用BLAST中间的Somewhat similar sequences (blastn)选项
而不是缺省选项megablast |
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h***e
发帖数: 232 | 8 如果不是低级失误，比如正反引物弄成同一方向，序列输错了，我还真不信有人能靠看
看，就说引物错了。
要不你拿的炸药奖的PCR文章里的引物给他看看？
这种小老板最喜欢拿着大老板的钱狐假虎威的装B |
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q*****d
发帖数: 445 | 9 请教大家一个技术问题。我用过一个荧光定量PCR试剂盒，效果挺不错，想了解一下引
物和探针的具体序
列，但是试剂盒里这些oligo DNA是混一起的，质谱很难分开。想了一个办法，把扩增
产物上T载测
序，就知道引物的位置，但是具体序列上只知道5‘端开始的序列，却不知引物的3‘端
序列具体在哪里终
止，因为一般引物大约18-25 nt长度，有很多的可能性。各位有没有什么办法解决这个
问题？ |
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c*****0
发帖数: 109 | 10 第一次拿到设计的引物。想问问大家干粉引物稀释后应该怎么分装保存？
网上说先稀释成100uM保存，工作时稀释为10uM。这个意思是不是说应该把100uM的引物
溶液分装在N个小离心管中然后冻起来，然后用的时候先稀释一个管到10uM，用完这个
管以后再稀释下一个管到10uM? 如果是这样的话那每个分装多少适合呀？
我担心分装太多了反复冻融影响寿命。 |
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M****e
发帖数: 178 | 11 网上说先稀释成100uM保存，工作时稀释为10uM。
按字面理解，意思是，引物stock是100uM，如果你的PCR反应体系是20ul，就向PCR
mixture中加2ul的引物stock。
不过，我们做PCR，引物的工作浓度（在PCR反应体系中的浓度）是0.5uM. 我们会把引
物稀释成5uM，每管100ul保存。反复冻融没什么问题。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 12 如果你不指望看到东西，那你为啥要用单引物扩？
引物这个东西的扩增特异性是相对的，只要条件放得够宽，啥引物序列可能都能扩出带 |
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h**********r
发帖数: 671 | 13 我一般在Invitrogen合成引物。好奇的问一下大家，一般大家用来做表达的引物是什么
纯化级别的？我知道做突变的引物至少是PAGE纯化的。普通表达的我以前订的都是最低
要求的。
多谢！ |
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j****x
发帖数: 1704 | 14 普通PCR，引物长度在25以下的话desalted足够了，大部分qPCR用desalted也没什么问
题。长度超过30bp，特别是用于突变的，推荐用HPLC/PAGE纯化的，但是价格自然就飙
升十倍以上了。不过听很多人讲用desalted的引物做突变也没什么问题。
记得以前在国内的时候，合成引物的默认纯化方式就是PAGE，很便宜价格没这么离谱啊
，不知道为什么 |
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f*****f
发帖数: 195 | 15 首先ncbi上找到该基因 基因组序列和mRNA序列，
两个引物之间的intron越长越好。引物在exon和intron的边界最好，mRNA amplicon长
度我习惯设定100bp左右。
你可以下载一个perlprimer，有real-time pcr的选项，操作界面比较简单，你选择一
个引物看看在genomic/mRNA的哪个位置就应该大致明白了。 |
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n******2
发帖数: 971 | 16 在文献中得到引物序列，想知道引物在基因上的位置，以便于知道产物长度，中间是否
有intron,某一引物是否跨exon... 我现在都是先在ncbi做blast找到reference
sequence,然后根据列出来的exon碱基位置一点一点对照，做得很崩溃。有没有什么网
站能把基因名字和序列输进去就给出位置的啊？谢谢。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 17 我以前试验过好几种方法，包括我说的那个RNA ligation 的高大上方法，后来发现最
简单最有效的方法就是经典方法：
第一步. 用OligoDT做primer来合成cDNA
我推荐 SuperScript First-Strand Synthesis System
第二步.用基因特异的primer来克隆感兴趣的基因，注意引物要离基因的编码区的
开头(ATG)和结尾(Stop codon)至少有20bp距离（下面我会说原因）。如果基因
的GC含量高，可以用Herculase来做PCR, 不然的话我一般都直接用heat-activated Pfu
turbo.这样非特异带少。
第三步。如果上一步克隆得到的带太多，或者得到一个smear, 那么就再把得到的
产物简单过小柱子纯化后直接用nested primer重新再扩增一次，这样一般都可以
得到一个非常纯的条带。
Nested primer设计的时候必须在上一步用的引物的内侧（这个就是为什么第2步的引物
我告诉你说离开头和结尾有至少20bp距离,就是为了给Nested primer预留地方的）。
primer? |
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K**********e
发帖数: 188 | 18 做实验也做了3年多了，这个月新到一个实验室。
这周刚刚开始实验，实验室小老板让我设计个引物，设计好给他看下。
结果我弄好给他，他告诉我错了 。。。
郁闷中。设计个引物都错，是不是没法混了 。。。
被人耻笑吧 。。。 |
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s******a
发帖数: 472 | 19 最近一直在和PCR较劲，至少有2个星期了。
用的上下游引物都是100bp（20bp的priming sequence），模板是质粒DNA，酶是
finnzyme HD hotstart polymerase。
特别难P出来，曾经走狗屎运P出来过，但是极其难重复。
哪位大拿能指点一下这么长的引物PCR的技巧吗？ |
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s********n
发帖数: 2939 | 20 像你这种情况正确引物的浓度不算低，annealing temperature是关键！ |
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m******n
发帖数: 121 | 22 forward的那个有90＋，其中有大约60bp的尾巴；下游那个就是一般的20＋左右的引物
，从质粒上面p大约1.5k的片段，因为从来没有用过长引物做pcr，所以不知道要怎么样
优化。万一搞了半天出不了，老板又要有意见了，所以先来打听一下～～～谢谢～～ |
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j****x
发帖数: 1704 | 23 拿质粒作模板，而且还只有1.5kb，基本上闭着眼也能扩增出来的，呵呵。直接2-step
PCR，不用退火，变性后直接72度延伸，可以有效减少引物二聚体的影响。前提是引物
Tm值均高于72度（这个应该不难） |
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C*******e
发帖数: 4348 | 24 没什么问题
就是订的引物要当心
这么长
要不你要求PAGE纯化
要不自己PAGE纯化
不然等你拿到clone结果在引物的部分有错或者短了什么的就要哭了 |
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L*****t
发帖数: 56 | 25 长引物的主要问题是5'容易丢碱基，我一般建议设计的时候多加几个保护碱基而不是纯化。PAGE纯化很贵，何况本来长引物产率就不高，纯化后就更少了。 |
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u**********d
发帖数: 573 | 26 可以试试NCBI的primerblast.贴上人源基因的CDS序列，让系统设计引物，然后用小鼠
的transcriptome来过滤。系统会同时自动返回每对引物在小鼠transcriptome里可能性
比较高的靶基因。我可能说的不太清楚，你自己去一看就明白了。 |
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o***e
发帖数: 12 | 27 自己设计的用来做qPCR的引物，primer 5.0设计的，理论上的产物应该是98bp。我先是
用PCR对cDNA进行了三十个cycle测试了一下引物，结果P出来很纯的一条带，在300bp附
近，去测了一下序列，结果258bp，而且还是同一个基因。。。。。。。。。
这是咋回事啊？大家说说看？
难道是RNA里面可能含有DNA，然后做RT-PCR的时候还在，导致PCR就直接在DNA的基础上
扩了？
汗死了 |
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f*****f
发帖数: 195 | 28 比较基因的表达差异你是指mRNA水平？与原核不同，转录mrna会有剪切。
因为你提取RNA做qPCR时，有时不可避免的混入微量的基因组DNA，为避免检测干扰，一
条引物分别与不同的exon匹配，减少干扰。有专门的qPCR软件，比如免费的perlprimer
就可以，粘贴mRNA和基因组序列就可以了，引物对会有打分。 |
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t*****t
发帖数: 773 | 29 有没有类似 RT-PCR引物库 一样的网站？ 收集一些研究结果和甲基化PCR引物的网站？
谢谢 |
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j****x
发帖数: 1704 | 30 需要设计50对基因组扩增引物，要求是PCR产物片段大小在2Kb左右，amplicon的GC
Content需要设定在48%上下浮动5%。自用的网上的引物设计工具都没有找到针对产物GC
Content的参数设定，哪位能给指点一下？
谢谢！ |
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b******n
发帖数: 4225 | 31 针对一个基因用了20-30个引物
有什么软件可以自动生成一个图标示出每个引物在模板上位置
类似下面这种，能标示出具体位置更好
谢谢
A B C
-> -> ->
==================================
<- <- <-
D E F |
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H**1
发帖数: 34 | 32 小弟设计了一些primer，用来做RT-QPCR，检测几个基因的mRNA在WT和KD细胞的变化。
设计好了primer，小弟先在WT和KO细胞测试引物的efficiency。
小弟把cDNA稀释成1：5，1：10，1：20，1：40，然后做QPCR，计算efficiency。
结果发现同一个引物，在两个细胞系的efficiency居然不同。
请教这是为什么？
着急。 |
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n****3
发帖数: 543 | 33 用常规40－50bp左右的引物彼此重叠20bp去pcr,很容易得到你的产物，很少有突变的，
挑2－3个送去测序，一定有你要的正确克隆。hplc纯化的引物也不是100%没有突变的，
而且超贵 |
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x********e
发帖数: 35261 | 34 引物温度只看会match的碱基,大概是(A+T)*2+(G+C)*4
克隆引物后面加酶切位点也不影响温度,一个道理 |
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H*******i
发帖数: 196 | 35 引物二聚体吧，首先看看能不能重新设计引物，减少二聚体，要不最好换策略，因为构
建library，一个个测序费时费力，要么就是pcr中那些减少二聚体的方法，不过效果不
一定好 |
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H*******i
发帖数: 196 | 36 deltaG到不是很夸张，-10算是可以接受吧。 不过关键一点是你的序列是完全反相互补
的，其实这种设计个人觉得不好。最好是
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这种设计，保证两段引物和模板退火温度，还有两段引物重叠部分退火温度差不多（我
一般PCR设置退火用60-65）。
ACCGCCCGCGAGCTGCACAAGCTGATCAAACGGGTCAGCCGCAAGCCGGTGCTGGAGGTGATCAACACCAACTACT |
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l******n
发帖数: 298 | 37 有一个公司卖的30个引物的混合物。有什么办法能知道每个引物的序列？
不懂才问！ |
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v********a
发帖数: 646 | 38 Invitrogen的许多引物，都是不卖序列的。
IDT则慷慨得多，引物和序列一起提供~ |
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x*****e
发帖数: 309 | 39 低丰度的gene用gene-specific oligo 作为反转录引物据说效果好，效率不高可能和
gene-specific oligo设计以及RT酶有关。RT 一般42度，而普通PCR引物设计时候的退
火温度远高于42度， 可能设计6-12bp左右的gene-specific oligo效果比较好；选对模
板二级结构不怎么敏感的RT酶吧，能反转录的cDNA越大越好，6kb以上的应该就够了。 |
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发帖数: 1 | 40 taqman也得需要引物，而且比sybr green 还要多一个探针序列 |
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q*****d
发帖数: 445 | 43 我从不用软件，我用www.yeastgenome.org网页上的在线引物设计。 |
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f**d
发帖数: 1952 | 44 谢谢回贴的各位! 以前一直用VectorNT的(买的正版),后来是免费版, 这两年没做PCR了
, 现在发现原来的VectorNT都用不了了. 所以向各位请教.
最后是用了NCBI网页上查完基因后的"Pick Primers"功能选了几对引物, 感觉比较省事
. |
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v***a
发帖数: 1242 | 45 我一般是直接加水成50uM的，然后放在4C。。。有一次碰到引物不好用了的情况 |
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n*****r
发帖数: 78 | 46 质量哪个相对好一点？我以前一直在operon买，MWG Biotech, Operon
Biotechnologies, and Medigenomix合并后，引物质量下降不少。 我一直在做Taqman
qPCR, 最近在operon买的probe有点问题。ABI的又太贵，大家有什么推荐？ |
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h******y
发帖数: 1374 | 47 请教如何在PCR的引物的设计中能够规避splice variants的问题？ |
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r****m
发帖数: 46 | 48 电脑装了windows7，发现很多软件不支持32或者64的了
大家都用什么设计引物？ |
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k*********u
发帖数: 614 | 49 请问下
大约20个碱基的引物 一般级别就好
大概多少钱？
请推荐几个公司
谢谢了！！！ |
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g*******f
发帖数: 427 | 50 大家好，我现在打算用ChIP 做一个转录因子对IL8 的作用，看到一篇JBC文章上的
ChIP IL8 promoter 的引物，可是我primer blast 发现根本就不是IL8， 看来只好自
己设计了，我想请问一下有没有专门的转录因子结合位点的序列数据库，比如IL8
promoter 上 NFkappaB 结合位点的序列等。多谢了 |
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