t****p
发帖数: 1504 | 1 最近刚参加了一个Cold Spring Harbor的会议，听到一个talk，觉得真是激动人心。特
此跟大家分享一下。
简单的来说，就是质谱能够鉴别磷酸化的peptide，如果分辨率够高，加上定量，那么
就可以看到整个细胞在某种刺激下蛋白磷酸化随着时间的动态变化。
关键词：
定量的实现：假设同时培养两盘细胞，一盘是正常的培养液，一盘含有稳定重同位素的
arginine和lysine。第一盘加EGF，第二盘对照。如果把两盘细胞等量混合，就可以 看
到某个磷酸化peptide的相对变化。
富集：TiO2可以特异地富集磷酸化的peptide。
分辨率和灵敏度：是不是所有可被磷酸化的peptide都可以被检测到呢？由于人们无法
估计总共有多少磷酸化的peptide，所以不知道能cover百分之几。总之大概有10000个
磷酸化的peptide被检测到。
多点磷酸化：也可以看到。甚至是某个位点的磷酸化依赖于另外一个位点，也可能获得
信息。
定位：把蛋白分为胞质蛋白和核蛋白，可以提供蛋白磷酸化后穿梭细胞核的信息。
时间动态：比如加入EGF，处理不同时间。
Cluster：把磷酸化动态变化相似的蛋白 |
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D****g
发帖数: 275 | 2 读Paper的时候发现，人们常用Drasophila的细胞共表达转录因子和Promoter Reporter
质粒去检测转录因子对Promoter的作用，我不明白为什么不用Mammalian细胞而是用昆
虫细胞哪？
另一个问题是文章中常用COS细胞表达转录因子，然后提取核蛋白，EMSA检测该蛋白与
Promoter序列的结合，不明白人们为什么倾向于COS细胞而不是别的细胞例如HEK293?
有没有人知道？ |
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r*****5
发帖数: 1876 | 3 RT，
想把细胞核蛋白和其他的分开，两部分都要，试了PIERCE公司的试剂盒和实验室自己的
一种方法，但是总感觉分离的不干净，有哪位XDJM有好的方法么，谢谢 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 4 和大家讨论一些实验的问题
背景：老板要一个融合蛋白，本来在海胆（Sea Urchin）里表达的，分子量~85KDa，叫
Dishevelled，至少有磷酸化的修饰，在Wnt pathway里很重要一蛋白。想和一个tag连
在一起，其实最主要的是想得尽可能多的有正确修饰、折叠的天然蛋白用来做Far-
western blotting研究蛋白相互作用。可是我们都没有表达真核蛋白的经验，用E.
coli肯定不行。in vitro转录可能表达量不够，做一个Far-Western Blotting要1~50
μg的蛋白用量，而且指不定得做多少次来摸条件和重复呢。
要求：1.正确的修饰、折叠等等；2. 表达量大
问题：1. 用什么kit，细胞可以达到以上要求？有人推荐老板用昆虫细胞。
2. 自己做还是找公司做？我倾向于找公司或lab合作做但不知道有哪些公司可以做。大
家推荐一下吧。想合作也可以，嘿嘿。
多谢！ |
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n**********1
发帖数: 251 | 5 对于实验刚刚入门，因为实验需要，要提取不同细胞部分的蛋白，比如总蛋白，膜
表面蛋白，膜蛋白，胞浆蛋白和核蛋白，大致的原理和具体的方法不是很了解，希望高
手能够指点一二，尽快上手，非常感谢了啊。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 8 大家不敢说啊……怕说了可以然后你实验做不出来…… |
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F**********e
发帖数: 158 | 9 should be no problem
we did a lot before |
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j*****j
发帖数: 39 | 12 太简单了，估计大牛都不愿意回答。-80放一周都没有问题，而且能增加蛋白的提取效
率，帮助膜蛋白脱落。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 13 Do you need activity? If it is just for Western, you can put it in -80 for
awhile. Some protocols for cell lysis actually call for freeze/thaw cycle. |
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m*****u
发帖数: 15526 | 15 我提核蛋白。lysis buffer里有0.4M NaCl, 10%glycerol。感觉对BCA法测量干扰很大。空白的
lysis buffer测出的值就很高。有什么别的办法可以解决么？ |
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D******9
发帖数: 2665 | 16 需要从大肠， 心等几个组织中提取蛋白做IP， 蛋白是核蛋白， 是个转录因子。 谢谢
。 |
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w**t
发帖数: 52 | 17 我遇到过好几次用Ecoli表达真核蛋白都是truncation，
应该是codon bias的问题，用Rossetta能好一些。
或者换insect cell。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 18 just to be curious, how do you know the c-terminus is missing? Using
antibody targeting c-terminus?
Have you checked the sequence to see it's in the right open reading frame?
Is that the bacteria have some protease to chop the protein off?
Alternatively, you can turn to baculovirus expression. But you need to
change the whole system in that case.
I am doing the same thing and being frustrated.... |
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w*********e
发帖数: 98 | 19 It is a N-terminal GST fused protein. I did western using GST antibody and
detected a smaller size band. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 20 GST表达的蛋白好像挺容易产生GST only的，
25 kDa左右
你有试过别的tag么？
比如N-his
或者C-his
and |
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w*********e
发帖数: 98 | 21 The band is bigger than GST. It is around half size of the full lengh
protein. I am thinking that probably the sequence of the protein is not
easy for bacteria to translate. I am wondering if there are some conditions
could overcome this problem. |
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n***w
发帖数: 2405 | 22 If you use pGEX2T vector, then the GST is about 29kDa. If your observed
differences were within the 3-4 kDa range, then it may be fine.
Also, you can use some online tools to see if your proteins have rare amino
acids or not. Codon bias may exist. |
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n***w
发帖数: 2405 | 23 If codon bias does exist, as someone here suggested, you can use Rosetta-gami series competent cells or
other strains that are capable to translate rare amino acids.
Besides GST-tag antibody, try some antibodies that target your protein. Then you may have a better picture
what is going on here.
I met almost the same problems as you. First I found I didn't use the right strain. Then I realized my sequence
contains many rare amino acids. |
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w*********e
发帖数: 98 | 24 Do you have any link for checking rare amino acids? Thanks
amino |
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w*********e
发帖数: 98 | 26 Thank you so much! I am going to check now. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 27 如果是codon bias
可以
1.用某些特殊的BL21(DE3)菌株，具体不记得哪些选择了，自己去搜一下
2.实在不行可以codon optimize，换成ecoli喜欢的codon
conditions |
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f**********s
发帖数: 1415 | 29 检测核蛋白，用tritonx-100作permeabilization效果很差，有其他试剂推荐吗？ |
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e****s
发帖数: 1125 | 30 难道现在回帖都要高喊一声Sunny?! hehe
不知道别的地方，我们实验室做Expression test的标准程序是lysate和Sup都要检测，
用WB。特别要是用E.coli来表达真核蛋白，很难在考染里看到Overexpress的条带。
建议直接做WB，其实是省时间的。
buffer, |
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L****S
发帖数: 76 | 31 考虑同时染CD44/CD24 和HISTONE （DURAL IMMUNOSTAINING）， 但是CD44/CD24 是膜
蛋白，实验室以有的透膜方法 （TRITON, ACETONE,SAPONIN) 都尝试了，但是无论用哪
种方法， 透膜后，CD44/CD24 所剩无几。 但是不透膜，又染不出HISTONE。
大虾们有什么好的PROTOCOL 吗？
拜谢。 |
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s******y
发帖数: 220 | 32 好不容易，被针扎了以后，结果有了improve：）
我提取了nuclear fraction后，那个suspension很黏糊糊的，应该是DNA很多的原因吧？
anyway，我用针头fitler了好久，然后做WB。
结果能看到我要的带，但是背景很高，看图，
我又把膜多洗了几遍，也没明显效果，请问有什么办法，能消除背景吗？
很明显，旁边的cytosolic 同一个蛋白，就没这个背景问题，谢谢。
BTW, 目标蛋白是150kd左右的那个，图片上是不同的曝光时间的结果。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 33 load太多了，或者DNA太多，或者盐太高
吧？ |
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Y**********j
发帖数: 369 | 34 DNA酶消化，降低上样量（10x?)，加大洗涤体积和时间，等等吧，效果会好很多的。实
在不行沉淀重溶一次，也会好一些。
吧？ |
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Z******5
发帖数: 435 | 38 因为目前手头只有actin的抗体，想问问用这个行不行。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 40 If you are doing nuclear extract and you can see actin...then your technique
is not perfect yet. |
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b**j
发帖数: 415 | 41 maybe you can, if no actin signal for nuclear fraction, then your extraction
is good |
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W****C
发帖数: 1937 | 42
technique
这从何说起。。。核里的ａｃｔｉｎ也不少。。。。
他是要做内参， 不是要做marker， 如果真是不舍得买ｈistone的抗体，只是做个预
实验的话我觉得可以， 但是要发ｐａｐｅｒ的话可能不被接受－－抗体都不舍得买，
ｅｄｉｔｏｒ肯定不买账。。。。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 43 There is actin in the nucleus? I did a lot cyto and nuclear extracts and using sigma actin ab (the strongest one out there) you can barely see a band while the cyto is like 1 sec exposure...Submit your paper with actin as nuclear loading control, let's see what the
review will say. |
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s******y
发帖数: 28562 | 44 核里到底有没有actin 一直是领域里面在争吵的问题，
好像是有ARP (actin-related protein)，然后据说在某些特定情况下
actin 会进去。
当然，肯定不能用用这个作为loading control.
using sigma actin ab (the strongest one out there) you can barely see a
band while the cyto is like 1 sec exposure...Submit your paper with actin as
nuclear loading control, let's see what the |
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m*****u
发帖数: 15526 | 45 借这话题问一下，提核蛋白。提取液含高浓度盐和10%glycerol。用BCA法干扰很大，有
别的办法没有 |
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H****s
发帖数: 301 | 46 好孩子，你还是看了我推荐的那些人写的综述的。之所以bacterial display不行，是
因为能够functionally display在细菌表面的蛋白真是太少了。如果你用细菌表达过真
核蛋白，你应该会明白其中的难处。正确的蛋白折叠、可溶性、毒性对于bacterial
display来说是个很大的挑战。酵母不存在此等问题，但酵母的问题在于糖基化修饰。
保持联系吧，说不定以后我能帮你点小忙。 |
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A***g
发帖数: 191 | 47 我的蛋白就是抽提的不同human cell line的核蛋白，不是什么特定的蛋白。不过可能
buffer会有问题。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 48 一般而言如果是mono- or di- sumoylation 的话，和降解没有关系，
尤其是膜蛋白和核蛋白。
这个原则对于ubiquitin 也成立。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 49 是啊，
有细胞stainning就能看出是不是核蛋白了，但是一个个找太麻烦了 |
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