s*****t
发帖数: 107 | 1 PEI mixture 1ml ??
incubate 4 hour, then take them out
and add new fresh medium. for gfp, the effienciency should be around 80%. |
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l********e
发帖数: 636 | 2 for 60mm plate, 5ml pei mixture. for 6-well plate, 0.5 ml per well. |
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s*****t
发帖数: 107 | 4 请给个5ml（60mm plate）PEI mixture的配方。多谢~~ |
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p****y
发帖数: 95 | 5 PEI Transfection
Transfection:
1. Split 293T cells one day before transfection in DMEM/10% FBS medium:
a. 6 well dish: 0.5x106 cells
b. 10cm dish: 4.0x106 cells
c. 15cm dish: 9.0x106 cells
2. Prior to transfection bring all reagents to room temperature.
3. In a sterile tube dilute total plasmid DNA (ug) in serum-free DMEM w/o
phenol red (volume of media is 10% of final volume in culture vessel). Use
transgene: viral packaging (psPAX2):viral envelope (pMD2G) constructs at 4:2
a.... 阅读全帖 |
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l********e
发帖数: 636 | 6 写错了， 应该是10cm, 5ml. the original con of PEI is 10mm. dilute 1000.
prepare 2.4ml DMEM with 0.1ml pei. prepare DNA mixture with 2.5ml DMEM with
DNA. add PEI mixture to DNA mixture dropwise, incubate at RM 20m, then take
the medium out from the plate and add the mixture. after 3-4hour incubate.
take the mixture out and add fresh medium. |
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s*****t
发帖数: 107 | 7 DMEM是没有antibiotics和Serum的吧？
with
take
. |
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r***e
发帖数: 2539 | 8 你可能做的量少，我们都是磷酸钙转的，几十个大盘子，一般不换液。
买sigma的poly-Lysine，50ml一瓶的那种。1/10稀释，加到板子上，15分钟后，吸掉，
加培养液和细胞。 |
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g*o
发帖数: 769 | 11 when it works well, it can be about 100% |
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a********n
发帖数: 844 | 12 几乎100%，那个buffer的ph值据说非常重要 |
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n******u
发帖数: 418 | 13 100%我从没达到过，293一般60会有
20%太低了
ph很重要，我一般用6.95的 |
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j****x
发帖数: 1704 | 15 293T/293FT可以很容易到90%以上，293不太容易，70-80%是正常的 |
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o**4
发帖数: 35028 | 16 什么buffer的ph值啊？
我们是买了一个2*的BES，直接稀释2倍就用了啊 |
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h******1
发帖数: 16295 | 18 温度
温度是影响pH值的,买来的试剂再好,你也要在室温平衡一会儿.
效果好坏看沉淀大小就行了,所谓雾状沉淀,奶状就过了. |
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C******r
发帖数: 790 | 19 哪种方法好转染？磷酸钙，PEI，Fugin6, Lipo2000, Lipo-plus？
或者都不容易转染？就只好硬着头皮再一个一个往lenti-vector里装。MEF是否比较容易
被lenti感染？
Thanks for answer. |
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d******r
发帖数: 124 | 20 搭车同问，我的质粒13kb，转neuron，磷酸钙，V5 tag染色，效率很低，
共转的GFP倒是很好。在Hek293上试，一切正常。
大侠觉得是什么问题？ |
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l********t
发帖数: 2 | 21 pcdna3.1 v5-his和PCAGGS-GFP磷酸钙共转染原代神经细胞，然后染色GFP和V5tag，GFP
信号很强，但是V5信号非常弱，表达很低。但是HEK上共转染，GFP和V5都很强。是因为
PCDNA的promoter在神经细胞里不太好使吗？考虑要不要subclone到pcaggs载体里去。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 22 最近开始自己包装慢病毒shRNA，用的是之前组里师姐的protocol，基本上是基于TRONO
LAB的protocol。之前师姐包装的病毒，效率很高，基本上能KD八成到九成。最近我自
己包装了两次，浓缩后根据之前师姐包装的病毒用量感染肝癌细胞，细胞生长速度明显
延缓，形态改变也跟之前的相似。但是做western却只能看到很marginal的蛋白水平降
低，在有的细胞株甚至完全看不到KD。我用GFP质粒转染HEK293FT，效率很高，24小时
至少看到90%的细胞有GFP表达，然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。我现在有两个疑问，请有经验的战友指点：
1）师姐留给我的protocol上，转染HEK293FT的方法如下，以10cmdish为例：
prepare the following transfection mix:
10.0 ug GFP(or other gene of interest)
10.5 ug pLP1
10.5 ug pL... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 23 如题，lab里面之前一直用的磷酸钙沉淀法，个人觉得特别繁琐。我比较懒，想换用
lipo2000或者genejuice来转，我们一直用的是PLKO.1shRNA+PLP1+PLP2+PLP/VSVG系统
，在10cm dish里面操作。有谁使用这套系统制备慢病毒，并且刚好也用lipo2000或者
genejuice转染试剂的，甩一个你们的成熟的protocol给我吧，特别是各质粒的用量，
换液时间，收集上清的时间等参数，越详细越好啦。不想为了摸索条件再浪费1个礼拜
的时间了。
谢谢 |
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L*******r
发帖数: 5448 | 25 2011年8月18日 – 物竞编号：0K1J; 中文名称：三元磷酸钙; 英文名称：Calcium
phosphate ... 溶解性(mg /mL)：微溶于水（溶解度0.0025g/100ml水）， |
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a***h
发帖数: 1222 | 26 石灰石并不是控制磷的最有效方式，磷酸钙的溶解度还是挺大的 |
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d*****h
发帖数: 1892 | 27 比如说用PMMA系列的高分子加上磷酸钙的复合材料？这个方向有前途么？ |
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p****y
发帖数: 23737 | 28 不要买超市的罐装柠檬水，不新鲜，自己做的比较健康。如果怕柠檬酸，可以加点糖。
http://hqb.sysu.edu.cn/a30356.aspx
●夏季气温高，人体出汗多，尿液浓缩，各类结石病的发病率会增加1/3
●结石病的五年复发率高达50％，治疗结石病，不能光靠手术，还要改变生活和饮食习惯
●枸橼酸可以抑制含钙结石生成，橙和柠檬中就富含这种物质
炎热的夏天正在步步逼近，而在广州这种潮热之地，盛夏正是各类结石病的发病高
峰。记者日前在广州医学院第一附属医院微创外科中心了解到，该中心每年收治的结石
病患者约有6000多人，而每年到了夏季，病人的数量起码要增加1/3。该院院长、泌尿
外科专家曾国华介绍说，夏天天气炎热、人体水分蒸发快，尿液浓缩，一旦没有及时补
充足够的水分，就很容易引发肾结石、输尿管结石，出现血尿、尿液排不出和剧烈疼痛。
医学指导/广州医学院第一附属医院微创外科中心主任曾国华、泌尿外科副教授吴
文起
困扰：半数结石5年后会复发
“每年夏天都是泌尿系统结石病的高发季节，我们收治的患者起码比平时增加1/3
。”广医一院微创外科中心泌尿外科的吴文起副教授告诉记者，提起结石病，... 阅读全帖 |
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