h***w
发帖数: 411 | 1 我是做光学的,最近研究一个新型光学显微镜,可以动态高精度(deep subnanometer)测
量细胞的厚度分布,想找一些有意思的应用,比如有可能像cell migration, 细胞膜震动
之类。但是外行，无从下手，希望各位多给些建议。多谢。 |
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b*********d
发帖数: 3539 | 2 评论、私货咱不说，内容不错，正反两面都覆盖了，有脑袋的读者自己会分析。
我个人的观点，改良性状，比如抗倒伏，去掉过敏源蛋白等等基因改良在确认没有生态
危害和生物毒性基础上可以推广，这个没问题。至于抗虫抗除草剂的改良，你文章里也
提了，安全不安全，见仁见智。我是觉得不安全，得反对。比如你提到bt蛋白在碱性条
件下有毒。那如果有胃溃疡的病人吃了抑制胃酸的药，这时候上生吃了含有bt蛋白的水
果蔬菜（没有热处理），加上胆汁分泌多一些，进入本来就是碱性环境的肠道，会不会
就有危害了？bt蛋白水解成toxic polypeptide，破坏粘膜细胞的细胞膜，虽不致死，
但会不会至少影响消化吸收营养？有没有喂老鼠bt蛋白+胃溃疡药，看老鼠体重有没有
减轻的实验？
还有文章中的一些逻辑不能很赞同。生态环境脆弱，一颗小行星就可以把人类文明打回
石器时代，一点没错。所以人类就可以为所欲为随便造了？我的结论是正相反吧，正因
为脆弱，所以才要小心。你也提到了基因扩散不可逆转，一点没错。所以在比较确信引
入新基因的后果之前就贸然行事是不是太鲁莽了？DDT 666用了好多年，发现错了，毒
害了一代人，好歹农药还可以 |
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m******y
发帖数: 7 | 3 原来想用100000g离心的方法，很难找到合适的离心机，请教一下，各位有用过其他什
么好方法的，能不能给我protocol。多谢了！ |
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d****i
发帖数: 826 | 4 用36000g离心就可以。
膜蛋白general protocol应该是先lyse your cells. 36000 g is enough to spin
down the membrane. Then extract
membrane protein by proper detergent (solubilization), followed by your
purification strategy. |
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i***R
发帖数: 663 | 5 Fluorescent dye tagged antibody + FACS assay
蛋白得有能被识别的tag |
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V********n
发帖数: 305 | 6 这个就是FACS吧，能系统的screen所有膜蛋白么？ |
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V********n
发帖数: 305 | 7 多谢！
嗯，质谱也没办法分所有蛋白吧。不然，就没有antibody array一说了。俺主要是想做
一个膜蛋白的筛查工作。 |
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i***R
发帖数: 663 | 9 Biotinylation surface protein--> pull down --> MS / Elisa / Western etc. |
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V********n
发帖数: 305 | 10 多谢楼上各位。查到一篇Nature genetics的paper做的类似工作。Biotin label或者直
接抽膜蛋白跑２D胶也是很好的办法。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 11 质朴应该可以测所有蛋白了，
可以用silac 或者 iTRAQ 标记蛋白 |
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p****p
发帖数: 3360 | 12 膜蛋白疏水氨基酸多，trypsin酶切的片断可能很大。质谱覆盖的范围相对要小，所以鉴定要难些。不知道有没有其他蛋白酶比较好得可以解决这个问题。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 13 可以把paper名字告诉一下嘛。。。
谢谢！！！ |
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V********n
发帖数: 305 | 14 nature genetics • volume 25 • may 2000
PMID: 10802657
Large-scale identification of secreted and membrane-associated....
The idea is perfect! |
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K******S
发帖数: 10109 | 15 that's in year 2000. 2D gel is almost a dying technique in US now, although
lots of labs in europe are still doing it. |
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K******S
发帖数: 10109 | 16 with sequencing information from MS/MS, you don't need high sequence
coverage. A few well identified peptides are enough to identify a protein.
以鉴定要难些。不知道有没有其他蛋白酶比较好得可以解决这个问题。 |
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d*e
发帖数: 843 | 17 ●新闻中心记者 周襄楠 吕露英
在清华大学医学院教授颜宁的带领下，以党尚宇、孙林峰、黄永鉴三位清华学生为
主力的课题组，用了一年半的时间，在世界上首次解析了膜蛋白——大肠杆菌岩藻糖（
L-fucose）转运蛋白（FucP）的结构，并结合生化手段初步揭示了其工作机理。顶级学
术期刊《自然》在10月7日刊发了他们的学术论文“Structure of a fucose
transporter in an outward-open conformation”（岩藻糖转运蛋白向胞外开放构象
的结构）。
http://goo.gl/abX6
课题组部分成员合影（从左至右：党尚宇同学、王佳伟博士、颜宁教授、孙林峰同学）
http://goo.gl/nKGS
大肠杆菌岩藻糖转运蛋白结构
膜蛋白的结构生物学研究一直以来是结构生物学领域公认的重点及难点。而该论文
的前两位作者党尚宇和孙林峰在开始课题研究的时候还都是清华大学的本科生。
初生牛犊不惧虎——本科生接手结构生物学世界难题
膜蛋白存在于细胞的细胞膜上，它们是沟通细胞或细胞器内外的桥梁。各种营养物
质的运输，细胞内有毒物质的排出，以及细胞内外信息的交... 阅读全帖 |
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a***e
发帖数: 1010 | 18 土了吧，国内现在是喝依云水加冰。
据说，依云水单个小圆水分子会被自来水制造的冰块水分子进一步切割和活化来形成具
有强力细胞膜亲和性的双变极性水分子，从而快速渗透和吸收到细胞内，激活线粒体中
的 NAPDH/ATP 转换系统，消除衰老细胞，来提高饮用者的生命潜能。 |
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S*********g
发帖数: 24893 | 19 一个新的神创论流派的某些成员暂时放弃了太阳系、银河系、和宇宙是否有
几十亿年还是只有几千年历史的问题。但这些神创论者异口同声地主张，自然界
的宇宙和生物显示出“智能设计”的证据。他们争辩说，有些生物学结构太过复
杂，它们不可能通过随机突变和自然选择的过程进化出来，并把此现象称之为
“不可简化的复杂性”。根据进化论之前早已存在的神学论点，他们宣称生物必
须像设计捕鼠器或时钟一样被设计出来，也就是说，为了使设备正常地工作，所
有零件都必须同时存在。如果有一个零件缺失或者改变，设备则无法正常地工作。
支持智能设计的神创论者认为，由于“简单的”生物学结构如细菌鞭毛都如此复
杂，通过随机突变同时产生鞭毛的所有成分的几率无穷小。根据这种看法，更为
复杂的生物学结构（例如脊椎动物的眼睛）或功能（例如免疫系统）不可能通过
自然过程来产生，因此必须是由超自然的智能设计师创造的。
然而，现代生物学的发现驳斥了智能设计神创论者的观点。生物学家研究了
所有被断言为设计产物的生物学系统，证明它们如何能够通过自然过程产生。以
细菌的鞭毛为例，没有一种鞭毛普遍存在于所有的鞭毛细菌里。鞭毛的种类精彩
纷呈，有些简单，... 阅读全帖 |
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Z**********g
发帖数: 222 | 20 很多啊,如invitrogen的DiI系列,sigma的PKH26等. |
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t******k
发帖数: 5617 | 22 PKH26,PKH67这两个一红一绿正好，如果嫌贵就用CFSE吧 |
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s********n
发帖数: 2939 | 23 自由基致癌性有一部分正是通过氧化细胞膜产生的。
还有就是对于细菌而言，DNA虽然大部分集中在核区，但在一些特定阶段也可以与膜结
合，比如细胞分裂期。还有就是产生的自由基也能够对细菌的DNA产生损伤从而造成突
变。
所以我对这个技术直接运用在人身上还是持保留意见的。 |
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i******m
发帖数: 495 | 24 要做一个ELISA检测细胞膜上一个蛋白的phosphorylation. 按照protocol应该把细胞
lysis以后做sonication, 但是实验室没有sonicator, 有什么什么其他替代方法呢?
Freeze-thaw会不会把磷酸化给弄没了?
thank you |
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r******y
发帖数: 21907 | 25 我也在做plasma membrane protein的phosphorylation，不过我是植物蛋白，加triton
x-
100或者sds让membrane protein soluble，然后centrifugation 取上清，sonication
是打
碎细胞膜吧，对膜蛋白不好吧。ELISA你用的什么抗体？我估计要用phosphotyrisine
threonine的
antibodies·做Western |
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C**S
发帖数: 522 | 26 是很奇怪，会不会是signal peptide切掉后还有一些吸附在细胞膜/extracellular
matrix上？ |
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H****s
发帖数: 301 | 27 记得昨天有位兄弟说了一点关于lipid binding protein的故事，找不到了。可否请各
位帮忙回忆一下？谢谢。另外一个问题，假设一个蛋白有lipid binding domain，是不
是这个蛋白可以binds to细胞膜？并且这个binding是非特异性的（可以binds to
anywhere on cell membrane）？如果以上都成立的话，这个蛋白的命运如何？被细胞
吞入并且被降解掉（假设是异源蛋白）？谢谢。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 28 你这个也太发散性了。有domain不一定会bind, 会bind不一定bind细胞膜 |
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h**********r
发帖数: 671 | 29 兄弟我是个粗人，干发酵的。不知道这么多花花儿道道儿。瞎说说～
很多微生物或油料作物，会积累油脂形成lipid body，细胞膜表面上的lipid只是很少
一部分。
这些lipid body上面结合了不少蛋白。lipid body主要是甘油三酯（TAGs）啥的。不知
道对你有帮助没？
有兴趣可以翻翻下面的paper,更多的自己翻翻吧。
Protein composition of oil bodies from mature Brassica
napus seeds；
Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast；
The Gregarious Lipid Droplet. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 30 那谁给个总结
到底现在所谓synthetic living things有多少东西是artificial的有多少东西还是借
助现有的生
命体的？是不是完完全全都是合成来的东西，从细胞膜到蛋白到染色体，并且可以分裂
传代的，现在还
没有？ |
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H***e
发帖数: 223 | 31 周末用french pressure裂解细胞之后不能马上测酶活，需要等下一周去别的实验室用
超速离心机。我的问题是：
1. 我加等体积的50%甘油混合，然后保存在-80度冰箱可以么？如果这个方法不行，细
胞裂解液该如何保存呢？
2. 我关注的酶在细胞膜上，这样会有什么影响么？
3. 下周我需要用的时候直接解冻还是如何操作?
谢谢您的解答，非常感激。 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 32 不好意思可能会让你失望了，Wnt的diffusion和我们的实验体系其实不太相关，所以我
不太了解，具体怎么测量还真不了解，做immunostaining？in situ？GFP tag？
不过Wnt的diffusion和果蝇胚胎发育早期经典的bicoid、hunchback等morphogen的
diffusion有所不同。bicoid、hunchback等好像都是transcription factor，果蝇早期
的胚胎是合胞体，一个细胞膜内N多核，转录因子直接通过扩散可以如何，调控基因表
达；Wnt是ligand，要和细胞表面的受体结合后经过复杂的信号传导后才有beta-
catenin，c-jun等入核调节基因表达或者有细胞骨架的变化，所以Wnt的diffusion应该
还受到受体分布和下游信号传导的制约的。
我们做的海胆胚胎，早期是没有localized Wnt ligand，只有Wnt下游的蛋白，比如
Dishevelled，是localized，但却足以激活并限制Wnt信号通路只在局部进行。稍晚一
些Wnt8表达，加强了这种效果。
另外关于Morphogen diffus... 阅读全帖 |
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c*z
发帖数: 157 | 33 以前做过一个膜蛋白
IHC就是和其他蛋白一样的方法
IF只用甲醇(fix+通透)
做出来都是golgi pattern 没有在细胞膜看到任何东西 |
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w***u
发帖数: 17713 | 34 现在这个方面的trials比较多，但是肿瘤细胞膜上的特异性蛋白不太多，普通细胞也表
达，窗口期也短，毕竟肿瘤细胞和正常细胞基本上是一样的，好歹也躲过了免疫系统的
攻击了。 |
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s*******e
发帖数: 1010 | 35 特异性地分离某些细胞膜区域的方法一般只能基于脂类组成的差异来进行，富含胆固醇
和鞘磷脂的lipid rafts可以通过低温下用特定的去污剂增溶非lipid rafts的方法进行
纯化。你可以读几篇分离lipid rafts的文献然后试试，如果你的蛋白应激反应是向
lipid rafts聚集的话就能够分离出来————不过这个可是靠人品的。 |
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p********i
发帖数: 116 | 36 有没有什么方法可以筛选一个东西（比如神经递质）的细胞膜表面的受体？如果建立一
library,细胞表面表达不同的荧光受体标记的受体，然后在96well 里面分别加入连接
了比较有激发荧光的神经递质，然后用酶标仪去读数，大家觉得这个方法靠谱吗？有没
有类似的文献报导过？谢谢。
是不是有更简单的方法？ |
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W*********n
发帖数: 775 | 37 且那么多条带，每个条带都要100多刀，这么说我的四个样品，12泳道，120条带，要最
少12000刀？是不是太贵了点？老板觉得4000刀已经很多了。
这样的话，因为我想获取信息的蛋白不太可能在膜上，能不能裂解细胞，只获取细胞内
的蛋白来做分析，而不去裂解细胞膜上的蛋白？
您所谓的ＤＹＮＡＭＩＣ ＲＡＮＧＥ是啥意思啊，我菜鸟水平，你就科普一些来给建
议，呵呵，谢谢啦！ |
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s********s
发帖数: 67 | 38 mTOR的话题怎么没人聊了?每天等着看更新呢。leucine 的receptor 不在细胞膜上的可
能性有多大？
story
plasma |
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s********s
发帖数: 67 | 39 mTOR的话题怎么没人聊了?每天等着看更新呢。leucine 的receptor 不在细胞膜上的可
能性有多大？
story
plasma |
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o**d
发帖数: 3080 | 40 我觉得你是没有完全理解老师说的意思，或者是说没有完全领会其中隐含的意思。
有内有外是说生命体和外界环境是由某种物质（比如细胞膜，或更简单的脂膜）相对分离开的。
随时间变化是说生命体是变化的，时刻进行着某种化学或物理反应，而不是一成不变的。
响应外界刺激是说生命体能对外界的变化有所反应，改变自身或改变环境，是自身更容易生存下来。
这个定义缺少了一个元素：生命体所有的这些变化或者对外界的反应，都是为了自身更好的生存和产生更多的后代。但在界定低等原始的生物，或是生命体的有无时候，这个定义还是有用的。
一家之言，仅供参考。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 你问的问题其实很有意思。
肥皂泡其实类似最早的生命的外膜。其实，细胞膜本身的磷脂分子层就是某种
类型的肥皂泡。
但是，肥皂泡还不能说成是生命，因为肥皂泡不能维持他们本身的形态循环。
刚才有人说大肥皂泡分裂成小肥皂泡，这个还不能算数，因为分出来的小
肥皂泡不能慢慢变成大肥皂泡，而是从大肥皂泡分成小肥皂泡后，慢慢就没有了。
所以不具备维持这种形态的能力。
假如有什么东西放在里面，导致他们能够摄取环境里面的detergent 从而来
维持状态，那么就是一个原始的生命状态了。 |
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c********r
发帖数: 189 | 42
其实我要检测的是nuclear里的chromatin bound protein，所以histone H3比较好。我
在裂解之前，先count细胞，然后裂解细胞膜后，count nuclei （这时候nuclei可以被
stain）至少90%的细胞裂解了而且保有完整的细胞核。结果cyto里还有Histone H3，于
是我就无语了 |
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S******e
发帖数: 36 | 43 我曾经试过用不同的方法裂解细胞，比方说用低渗Buffer(10 mM HEPES (pH 7.9), 10
mM KCl, 1.5 mM MgCl2）溶胀细胞后，dounce 10次或者加1%NP40，每次我都用普通的
相差显微镜检查过细胞，溶胀后细胞膜没破，但Dounce或者加入NP40后，90%以上细胞
膜破掉，细胞核似乎还是完整的。可是当做WB时候，很多只在核内的蛋白（比方说转录
因子）都可以明显的在cyto的fraction里边检测到，我估计还是有渗漏。你能检测到H3
可能也是这个原因？ |
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c********r
发帖数: 189 | 44
其实我要检测的是nuclear里的chromatin bound protein，所以histone H3比较好。我
在裂解之前，先count细胞，然后裂解细胞膜后，count nuclei （这时候nuclei可以被
stain）至少90%的细胞裂解了而且保有完整的细胞核。结果cyto里还有Histone H3，于
是我就无语了 |
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S******e
发帖数: 36 | 45 我曾经试过用不同的方法裂解细胞，比方说用低渗Buffer(10 mM HEPES (pH 7.9), 10
mM KCl, 1.5 mM MgCl2）溶胀细胞后，dounce 10次或者加1%NP40，每次我都用普通的
相差显微镜检查过细胞，溶胀后细胞膜没破，但Dounce或者加入NP40后，90%以上细胞
膜破掉，细胞核似乎还是完整的。可是当做WB时候，很多只在核内的蛋白（比方说转录
因子）都可以明显的在cyto的fraction里边检测到，我估计还是有渗漏。你能检测到H3
可能也是这个原因？ |
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g*****p
发帖数: 451 | 46 哦，这样的话就很合情合理了
你开始的CHO分泌型表达，蛋白在培养基里面的浓度是很低的
一般表达良好的外源蛋白在CHO中最多也就1~10 mg/L，如果你的蛋白分子量在一般范围
20~50 kD, 那蛋白酶浓度也就0.02uM或者多点，况且pH比较高，酶的活性也低，所以你
能看到很多full length的酶，E.coli表达的东西都是包涵体，活性全无，自然也就大
都是
full length了
合成多肽切割实验不是证明有其他蛋白酶能切，而是证明它自己能识别这个位点，而且
可以
把动力学参数算出来，不过这个是反式剪切实验，至于你的自切是反式切割还是顺式切割
就没办法证明了
你说的pH induced 酶自切活性是个很有趣的发现
我觉得你得查查文献把这个酶的细胞定位搞清楚
因为在endosome pH5-6,如果酶定位在这里，那跟其生理功能是非常相关的
至少我知道的一个例子是流感病毒HA，它发挥膜融合功能的时候就是可以在endosome通过
pH induced构象变化，然后进行病毒－细胞膜融合
如果你的pH导致构象变化是有意义的
那做药就至少有3种途径了
1.catalytic site... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 47 你应该把细菌离心后用PBS洗两次，然后再放含染料的PBS.
另外，我不知道你具体用哪个dye, 但是在我印象中cell tracker这个dye
是通过和细胞膜表面上的分子连接而染色的，没有必要让细胞去“吃”。
LB |
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k***g
发帖数: 4904 | 48 先说一下问题背景：没有生物背景的在使用细胞做实验。。所以希望大牛能给我扫盲一
下。。
原来在用Celltracker Orange，$225/1mg, 稀释到5ug/mL使用。似乎working solution
不能储存太长时间，而且最近快用完了，考虑有没有更便宜，操作也简单的染料，替换
这个Celltracker Orange。最好是488nm左右激发的，可以有更多显微镜可以用，不过
别的波长的如果很便宜又好用也可以考虑。做的细菌有革兰氏阳性和阴性的，希望这个
染料就是随便什么细菌都可以染，而且基本保持细胞活性，最好不改变细胞膜状态，而
是钻进膜后固定在细胞内，可以维持一段时间荧光性能。请问有什么染料可以推荐的吗？
多谢多谢了！ |
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W****7
发帖数: 426 | 49 请教下哈~
有没有什么好的方法标记短肽（20-30aa）的？要求荧光分子比较小的，主要是想看这
个短肽到底能不能进到细胞内，还是只是结合在细胞膜上。或者不用荧光别的方法能检
测也行。。。。
谢谢！ |
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w********y
发帖数: 288 | 50 当然我知道可以查其他用这种药的paper看人家怎么说，不过要是能有个类似化学试剂
百科全书的地方能查，感觉比较权威些，不知道有没有这种文献，谢谢。 |
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