t*****z
发帖数: 1598 | 1 如题，有些啰嗦，诸位好心的看官如果课题紧张的话，只看题目就行啦。
我在做一个最最常规的把插入序列连接到载体里面的分子克隆实验。插入片段两边的酶
切位点是BamHI和XbaI，载体当中的酶切位点是BglII和KpnI。其中BamHI和BglII是匹配
的，可以连接，但是XbaI和KpnI不匹配。但是我为了赶时间，打算强行连接了。我注意
到KpnI是平端。我想先把XbaI用Klenow片段修平了，再连接到KpnI的平端上去。我的具
体实验设计如下：
把插入序列和载体用T4连接酶连接一段时间（连接BglII和BamHI末端），然后把T4连接
酶加热失活，然后加入Klenow片段（他们的缓冲液相互兼容），反应一段时间（把XbaI
末端补平），加热失活，再加入T4连接酶，反应更长的时间（把两个平端相连），最后
转化。
这个方案不知可行否？成功率大不大呢？可以做什么样的改进呢？
另外我对T4连接酶的效率比较好奇。以前读书的时候，都是连接过夜，至不济也要连接
四个小时。可是现在的T4连接酶的说明书上，都只要五分钟十分钟的，是现在的酶果真
都那么强吗？各位平时做连接都连接多久呢？
谢谢各位！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 2 内切酶还有碱性磷酸酶没有问题。在非洲一些医疗实验室里，这些酶都是放在室温保存
的。
其他酶，尤其是连接酶大部分得扔 |
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h**********r
发帖数: 671 | 3 几天没做克隆。今天早上一看，公用的放内切酶连接酶的-20C冰箱坏了，都室温了。是
不是这些试剂酶什么的都废了？郁闷啊！ |
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i***a
发帖数: 11095 | 4 n多年前做过，应该挺简单的
若是30bp的话
___________________
_____________________
如上图一样设计引物，中间15-20个碱基配对，两端再加上6个碱基的内切酶位点，再各
加3-4个保护碱基
正常PCR后，电泳，纯化，测浓度，各自酶切，失活，酒精沉淀，再溶，然后用T4连接酶连接
clony PCR的时候可以用primer之一跟vector上附近的一个primer试试看 |
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f**u
发帖数: 346 | 5 借地方问个问题。
Klenow到底为什么能修平？这个方法我是听前辈们说的，
是因为它的polymerase活性补平吗？如果是的话我做的时候是酶切产物直接加Klenow，
里面也没加dNTP，怎么可能给补平呢？
或者用的是它的exonuclease活性给切平？但是对于Klenow来说这个已经没有了。
还是说Klenow有多种不同的exonuclease活性？
另外不管是哪一个，好像对于5'粘端和3'粘端都是不一样的，
但我已经糊里糊涂地做过很多了，好像也没出过问题。
有人知道问题的答案吗？ |
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p*******r
发帖数: 156 | 6 最近本人在将一个6000-8000bp连接到pcDNA 3.1（+）(5400bp)中去, 使用普通的连接
酶至今都没有连接进去，真心向各位大虾请教，大家通常如何使用什么神奇的连接方法
和kit,thanks a lot |
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p*******r
发帖数: 156 | 7 最近本人在将一个6000-8000bp连接到pcDNA 3.1（+）(5400bp)中去, 使用普通的连接
酶至今都没有连接进去，真心向各位大虾请教，大家通常如何使用什么神奇的连接方法
和kit,thanks a lot |
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p*****n
发帖数: 981 | 9 ☆─────────────────────────────────────☆
sixtn (人在天地间如风中飞絮!!!) 于 (Mon Jan 29 00:24:15 2007) 提到:
最近，我在做一个双酶切的连接。最开始，在已经联入T simple vector的A段DNA序列
的一端有相隔四个碱基的两个酶切位点（XbaI和BamHI），然后用双酶切的方法把B段
DNA序列（两端带有相同的两个酶切位点）连进去。跑胶和回收都没有问题，大小也对
。但用T4酶或其它连接试剂盒连接后，再转化，总是长不出来。但其它同学用相同的试
剂做其它连接却能够轻而易举的长出来。已经做了三次了。对于原因百思不得其解，回
想实验过程是再简单不过，加液体这些也很难出错呀。化转也是很简单的步骤。不知道
哪里可能出问题了。
各位ggjj帮我分析一下可能原因好吗？多谢！
☆─────────────────────────────────────☆
goooo1111 (i!) 于 (Mon Jan 29 00:33:53 2007) 提到:
相隔四个碱基是不是少了一点？有些酶不切DNA尾巴， |
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m******5
发帖数: 1383 | 10 现在在进行一个大载体（13k）单酶切连接大片段实验
因为遇到种种问题一直不奏效，所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
方法设想为：将大载体单酶切线性化后，用PCR引物把线性化的质粒p出来，期中一端引
物添加一个新酶，之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切，就形成了两个粘性末
端，于是就成为双酶切连接。
请问这样可行么? 另外 ，ＬＡ Ｔａｑ引入突变的几率大么
另外，补充问题，这么大的质粒用ｐｆｕ做定点突变靠谱么／ |
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o*****y
发帖数: 699 | 11 11101433 彭君 中南大学 “补丁”马氏过程
及其相关问题的研究 A0110 青年科学基金项目 22
2012-1-1 2014-12-31
2 11101434 徐勇 中南大学 无限时滞随机泛
函微分方程及其在种群动力系统中的应用 A011003 青年科学基金项目
22 2012-1-1 2014-12-31
3 11101435 周岳 中南大学 三类常数项恒等
式的数学机械化研究 A0116 青年科学基金项目 22
2012-1-1 2014-12-31
4 11102239 李地元 中南大学 ... 阅读全帖 |
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m****g
发帖数: 530 | 12 来自主题: _Harvard_Medical_School版 - 小G蛋白RhoA 2009年9月24日，北京生命科学研究所邵峰博士实验室在分子细胞（Molecular Cell）
杂志上发表题为“Cullin
Mediates Degradation of RhoA through Evolutionarily Conserved BTB
Adaptors to Control Actin
Cytoskeleton Structure and Cell Movement”的文章。该文章报道了一个特异性
调节小G蛋白RhoA降解和细胞骨架
及运动能力的新的泛素连接酶复合物。
泛素化修饰介导的蛋白酶体降解途径是真核生物中非常重要的蛋白质调节系统，能够维
持真核细胞内的蛋白质水平的平
衡，同时参与调节细胞周期进程，细胞的增值和分化，以及细胞内信号传导等多种细胞
生理过程。在蛋白质泛素化修饰
过程中，泛素连接酶负责特异性识别和招募底物蛋白分子。Cullin家族蛋白是一类介导
泛素连接酶复合物组装的连接分
子。作为Cullin家族成员之一，Cul3与具有BTB结构域的衔接蛋白组成泛素连接酶复合
物，并结合特异性的底物，介导
底物的泛素化。人 |
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x*r
发帖数: 11073 | 13 我今天比较忙，刚才抽空打电话问了问LD,他大概说了几点，如果你还需要讨论的话，
晚上可以电话:))
1，Colony PCR 不是很可靠，cycle 数目不可多，要少，最好是控制在25个cycle以下。
2，单酶切连接最好用CIP.
3,制备片段的时候，做酶切的酶是不是同尾酶？
4，Promega的连接酶比invitrogen的要好用。
5，连接片断是通过PCR还是通过酶切拿到的？PCR产物的话，确定有粘性末端吗？
新的 |
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m****g
发帖数: 530 | 14 蛋白质是生物体最重要的组成物质之一。在细胞内，各种蛋白质的产生、折叠主要在内
质网(endoplasmic reticulum ,ER)
上进行。然而在蛋白质的生产过程中，也常常发生错误，蛋白质可能出现错误折叠，在
环境胁迫下，细胞也可能产生并积
累有缺陷的蛋白质。若有缺陷的蛋白质在细胞类累积过多，将可能引起诸如阿兹海默症
、帕金森症等疾病。因此，有缺陷
的蛋白需要被及时的识别并清理。
细胞内存在一个蛋白质质量控制过程，其中HRD泛素连接酶(HRD-ubiquitin ligase)对
缺陷蛋白的识别起关键作用。HRD
泛素连接酶的功能类似于一种标记机器，当它识别出有缺陷的蛋白质后，会在该蛋白上
标记上泛素(ubiquitin)分子,随后该
蛋白将会被降解。但目前为止，科学家还不清楚这种酶复合体如何能够识别和标记各种
类型的蛋白质。
在最近的这项研究中，研究人员发现了HRD泛素连接酶最重要的“脚手架”——Usa1亚
基。Usa1亚基能够将该酶复合体的
各个亚基连接起来，组成一个完整的酶复合体。当识别并标记某些水溶性蛋白质时，
Usa1能够使Der1和Hrd1亚基连接起
来。
研究人员还 |
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C****o
发帖数: 1549 | 15 人类首次拍摄DNA复制！美科学家：人类理论完全瞎编，中学课本错误百出！
2017-06-21 环球科学大观 基因谷
近日，来自美国加利福尼大学的科学家Stephen博士在顶级杂志《Cell》上发表成果称
，所在团队创奇迹般的摄录了单个DNA分子复制的近距离高清无码影像。事实证明人类
半个多世纪以来“臆想”的模型是何其错误百出，此发现彻底改写我们高中所学的生物
知识，颠覆了整个科学界！
传统观念中，DNA双螺旋结构由4类不同碱基相互交织成链。在遵循碱基互补配对原则、
半保留复制与半不连续复制等规则的条件下，解旋酶、DNA聚合酶与连接酶等物质分别
作用于链状结构，使得新产生的遗传物质与母体完全匹配。
其中最为特征的现象是位于前导链与滞后链上的DNA聚合酶在某种程度上彼此协调，以
避免在解旋时引发突变。
团队的科研人员从大肠杆菌中提取出单个DNA分子并施加着色剂，令科学家震惊的是，
实时镜头显示出真实的DNA在复制过程中，连接酶并不相互协调，而是每条单链高度独
立复制，充满随机性，最后却能够完美与母链相匹配！
在镜头中，时而滞后链停止运行，但前导链继续增长，时而其中一条链突然以10倍正常... 阅读全帖 |
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b*******6
发帖数: 39 | 16 因为忙着找实验室，抱歉回复晚了。谢谢大家的帮助，特别是neverthink的耐心分析。
这件事情的或许起于实验设计，克隆路线的选择，引物的设计和载体的选择，引入了过
长引物，载体酶切位点过于靠近。再往前推一下，是因为自己过于相信自己，刚到一个
地方没有向周围人请教就把引物发出去了。虽然和一个高年级博士讨论过，但是没有和
老板讨论。
和老板及周围高年资同学缺乏有效的交流是最主要的原因。4个月大概只和老板交流了4
-5次，不和老板交流的原因最主要是觉得这么简单的事情没做出来，太丢人了，做出来
再和老板沟通。其实我到丁香园上翻了好多克隆失败分析的帖子，也尝试改进方法，如
加入一段片段在两个内切酶位点间。但是问题的关键是我没有向周围老板可以信任的人
或者老板询问改进方法，我的一些尝试没有得到他的认可（事实也说明只有在在内切酶
位点间插入片段是可行的，其他还有不少尝试我没说出来，比如说是否用碱性磷酸酶处
理、酶切时间长短、片段与质粒比例、连接酶连接时间长短、次序酶切与双酶切），他
是对的，博士生不是来改进技术的或者闭门造车的。几个月只做出几个克隆是一般人难
以接受的。
有一个可能也是存在的，如果... 阅读全帖 |
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n****k
发帖数: 516 | 17 最近经常做差不多大小的片段连接，可以参考下我的条件
1.载体去磷酸化
2.高效率感受态细胞
3.insert:vector大概6:1-9:1
4.足够的DNA，我10ul体系里面大概加100ng
5.我用NEB的连接酶，一般连接RT放一个小时
6.酶切时间不要太长，1-3小时+0.5-1小时载体去磷酸化
7.不要太相信酶切鉴定，我有一个载体，重做了2次，每次酶切位点都突变，可以连进
去，但是切不出来了，建议lz做PCR鉴定之后送测序。 |
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m****g
发帖数: 530 | 18 近日，诺贝尔基金会宣布，将2009年诺贝尔生理学或医学奖授予因发现端粒和端粒酶如
何保护染色体的三位学者。
什么是端粒和端粒酶呢？
端粒是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。形态学上，染色体DNA末端膨大成
粒状，像两顶帽子那样盖在染
色体两端，因而得名。在某些情况下，染色体可以断裂，这时，染色体断端之间会发生
融合，或者断端被酶降解。但正
常染色体不会整体地互相融合，也不会在末端出现遗传信息的丢失（被降解之类）。可
见端粒在维持染色体和DNA复制
的完整性有重要作用。
真核生物双螺旋DNA双链复制时，会有一小段DNA引物连接在复制的起始部位，在合
成酶的作用下，在引物后依次
连接上A、T、C、G（脱氧核苷），形成新的DNA链。复制完成后，最早出现的起始端引
物会被降解，留下的空隙没法
填补，这样细胞染色体DNA将面临复制一次就缩短一些的问题。这种缩短的情况在某些
低等生物的特殊生活条件下可以
观察到，但却是特例。事实上，染色体虽经多次复制，却不会越来越短。早期的研究者
们曾假定有一种过渡性的环状结
构来帮助染色体末端复制的完成，但后来却一直未能证实这种环状结构的存在。
20世纪8 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 19 喜欢Fermentas的酶。RE都换成FastDigest格式的，全部缓冲液通用，和其他修饰酶也
可以通用，做什么都不用换缓冲液，而且连loading dye也给你加好了，非常适合我这
种懒人。T4连接酶，号称室温五分钟（我没试过这么短的）。
克隆载体方面Fermentas有个pJET，便宜又好用，传统的平端T4连接，但是效率很高，
我每次只连15-30分钟，就长出很多克隆。阳性率100%，假阳性率0%，我有时甚至都可
以省下筛选这一步，直接养菌抽质粒了。美中不足的是载体上的常见的酶切位点少了点
。与之相比的QIAGEN的pDrive，也挺好用，但是阳性率不是那么高，。每次还是不得不
挑那么四五个菌落来做PCR鉴定。Invitrogen的TOPO TA载体们，我们实验室和隔壁实验
室用起来都很不顺利，我现在弃之不用。
Invitrogen的Gateway载体们，虽然贵，没办法，只能买他们的，感觉Gateway这么方便
的东西还是只此一家。效率不高，有时会出问题，但是勉强够用了。我曾自己试图构建
类似于pDONR的载体，失败，原因复杂，一言难尽。不喜欢NTI，宁可用最土的BioEdit |
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S***6
发帖数: 431 | 20 Insert的基因全长4.6kb，载体3kb。
一开始用一种Fast cloning的方法，就是对载体和Insert都PCR，然后两个接头处保留
有16-18bp的overlap，混合后直接转化E.coli，这种方法在我们lab对于3kb一下的
subcloning都非常有效。可惜得到的是部分插入的克隆，只插进去N端的200bp和C端的1
.3kb，分析后怀疑是Insert的序列中包含6bp的重复序列，可能发生了self-
recombination。
现在回到传统的方法，PCR后先连接到T 载体，但是也还是得到部分插入的克隆，这次
插入的序列只有N端的大约1kb左右。
现在这个Insert只是从RT 产物中得到的PCR 片段，所以无法突变修改容易引起自我重
组的序列。
另外一个怀疑的地方是现在的连接酶太高效了，连接只需要5分钟到15分钟，这么高效
的连接是不是也很容易造成DNA片段内部的重组啊？形成一个Loop，然后一大段中间序
列就这样miss了。
大家帮我分析一下这种大片段丢失的现象究竟是Insert中含有容易自我重组的序列，还
是连接酶造成的？还是两个因素可能都发挥了作用？还是... 阅读全帖 |
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A*******e
发帖数: 284 | 21 谢谢诸位！我这个是因为需要建library，最好达到10(9)，最低也得10（7）才
能说得过去，所以要求很高的浓度和效率。也有可能是自连，就是在两个酶只有一个酶
成功切了，而另外一个没有切的情况下，肯定自连。因为需要连接的效率，所以ALK之
类的处理被排除。也不想分布酶切，因为首先有共用buffer，其次我不想多纯化一次损
失我的vector.按诸位的意见，我打算降低单个酶切反应dna的量试试看。另外我这两个
酶切位点相距12bp，我想不会相互干扰。 这12bp中还有另外一个酶切位点，也是同样
的工作buffer，我想先用双酶切后，再加点这个酶，争取把那些漏网之鱼逮到干掉。
诸位有好主意，请不吝赐教！谢谢 |
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f***y
发帖数: 4447 | 22 国家应该花大钱引进这类人才。
哈工大报讯（闫明星/文）1月9日，我校生命学院黄志伟教授研究组在《自然》（《
Nature》）在线发表了题目为《艾滋病病毒Vif“劫持"人CBF-β和CUL5 E3 连接酶复合
物的分子机制》（Structural basis for hijacking CBF-β and CUL5 E3 ligase
complex by HIV-1 Vif）的研究论文。该项研究第一次揭示了艾滋病病毒研究领域一直
关注的艾滋病病毒毒力因子（Vif）的结构，破解了这一领域30余年的谜团；阐明了Vif
如何“劫持”人CBF-β以及CUL5 E3 连接酶复合物的分子机制；为理性设计靶向该复合
物的全新艾滋病药物提供了结构基础。该项艾滋病研究领域里程碑意义的研究成果对人
类最终攻克艾滋病具有非常重要的科学意义和临床应用价值，也标志着我校在艾滋病结
构生物学研究领域走在世界最前沿。
该文章被选为精选文章在同期《自然》杂志《新闻与视点》栏目中撰文重点推荐。
该文章发表实现了我校在《自然》（影响因子：38.60）杂志上发表研究论文零
的突破。黄志伟教授为本研究... 阅读全帖 |
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s*******e
发帖数: 1010 | 23 貌似单酶切链接总是反向连接产物多一些，似乎携带无意义编码的DNA的质粒总是比有
意义的具有生存优势。colony PCR几乎是必须的后续手段，酶切鉴定我一般都不做。 |
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c*****u
发帖数: 174 | 24 端粒通常是由富含鸟嘌呤核苷酸(G)的短的串联重复序列组成，伸展到染色体的3，端。
一个基
因组内的所有端粒，即一个细胞里不同染色体的端粒都由相同的重复序列组成，但不同
物种的
染色体端粒的重复序列是各异的。哺乳动物和其他脊椎动物染色体端粒的重复序列中有
一个
TTAGGG保守序列，串联重复序列的长度在2 kb到20 kb之间。
端粒的重复序列不是在染色体DNA复制时连续合成的，而是由端粒酶(telomerase)
合成后
添加到染色体的末端。端粒酶最早是在四膜虫(Tetrahymena)中发现的。1985年，
Blackbaurn
和Greider发现人工合成四膜虫端粒的DNA片段(TTGGGG)4，可被四膜虫细胞抽提物中的
一种活
性物质加长，这种活性物质对热、蛋白酶K和RNA酶都敏感。端粒区内的DNA重复序列的
结构是
很特殊的，是一种单链断开的结构，可以不受DNA连接酶的作用。此外，最末端的一些
碱基可
能是“发夹”结构，这样就不会被核酸酶识别而免遭降解。
端粒酶将自身RNA模板合成的DNA重复序列加在后随链亲链的3’端，然后再以延长
了的亲
链为模板，由DNA聚 |
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E*C
发帖数: 1629 | 25 谢谢各位的回复.
是我没叙述仔细,请见谅.
我要检测的酶是血浆中的某种serine 蛋白水解酶,血浆中类似的酶很多.我现在知道的
就5种.我的短肽里面 有6个HIS(是连接片断,我写第一帖时没算进去) 和6 个GLYCINE,
血浆中是否有识别这些位点的酶,我还不清楚( 请大家不要BS我) 其他的有丝氨酸,异亮
氨酸,谷氨酸和精氨酸. 都可能被非特异切割.
我的酶识别位点主要是精氨酸和它前面的甘氨酸,这个在我合成片断的中间.
这回说清楚,各位看看是不是更无解了?
多谢 |
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b******s
发帖数: 1089 | 26 虽说理论上这两个酶在大部分buffer里活性都不错。但实际上并不一定所有的组合都好
用。
尤其是有时候在非最佳的buffer里会有star acticity。如果同时做双酶切出现问题，
可以考虑做sequential digestion。你不必每步都抽提，可以先用离子浓度低的buffer
第一个酶先切，然后换成离子浓度高的buffer，用第二个酶切。如果切的时间足够长，
酶量足的话，我觉得不一定要加CIP，这样会促进其后的连接效率。 |
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s*****g
发帖数: 87 | 27 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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s*****g
发帖数: 87 | 28 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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s*****g
发帖数: 87 | 29 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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d**********9
发帖数: 981 | 30 一个质粒上只有两个酶切位点NheI和AscI，但是我要连接两个不同来源的PCR产物，酶
切后一段含NheI和BamHI,另一段含BamHI和AscI,可不可以直接将3段连接？有什么办法
可以提高效率？请求高手帮忙，多谢多谢！ |
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b*********e
发帖数: 870 | 31 9.5K我做过assembly PCR，但是用普通的酶切连接做的clone。PCR以后，突变率还是挺
高的，还是分段搞好、测序以后，切出来，再连接比较稳妥。
室温过夜，会完蛋吧？酶活就没了啊。压缩到2ul是我的一个同事测试出来的，呵呵。
我们老板是省钱牛人，在他带领下，大家都好有省钱的激情。。。汗~ |
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W*****B
发帖数: 4796 | 32 这个比施一公和彦宁做的东西有意义多了吧？
：人类首次拍摄DNA复制！美科学家：人类理论完全瞎编，中学课本错误百出！
：2017-06-21 环球科学大观 基因谷
：近日，来自美国加利福尼大学的科学家Stephen博士在顶级杂志《Cell》上发表成果称
：，所在团队创奇迹般的摄录了单个DNA分子复制的近距离高清无码影像。事实证明人类
：半个多世纪以来“臆想”的模型是何其错误百出，此发现彻底改写我们高中所学的生
物知识，颠覆了整个科学界！
：传统观念中，DNA双螺旋结构由4类不同碱基相互交织成链。在遵循碱基互补配对原则
、半保留复制与半不连续复制等规则的条件下，解旋酶、DNA聚合酶与连接酶等物质分别
：作用于链状结构，使得新产生的遗传物质与母体完全匹配。
：
：其中最为特征的现象是位于前导链与滞后链上的DNA聚合酶在某种程度上彼此协调，以
：避免在解旋时引发突变。
：.......... |
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a****o
发帖数: 1786 | 33 你的产物的某一端如果正向连接可能形成Stem-Loop结构, 容易被细菌内的酶切开 |
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m******5
发帖数: 1383 | 34 前的状况是单酶切AGEI,用T4ligase过夜后转化
菌系试过DH5alpha和Top 10。
所有连接都是反向的。
目前的情况是质粒没法做任何改动，只能在insert上做手脚，但问题是不知道症结在哪
里从何改其 |
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b**********8
发帖数: 349 | 35 我之前做TA的时候也遇到过这样的情况，我要的是反向链接的，不过连续挑了30几个都
是正向的。后来老板告诉我挑克隆的时候注意同时挑一些个头大的菌落和个头小的菌落
。我发现那些个头小的过夜摇菌的时候长的很差，不是那种均匀的浑浊，而是一团白色
的粘糊糊的附着在tip上，其实之前那30个里我也遇到过这样的，当时以为是污染了于
是把菌液丢掉了，没有抽提。最后那次把所有的菌液抽提，经酶切验证发现那些个头小
的摇菌后呈白色团块状的就是我要的。后来猜测估计反相连接的序列可能会在菌体内表
达某些有毒性的蛋白，所以不容易挑到。 |
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j******n
发帖数: 941 | 36 用的Origene pCMV6-Entry的骨架
发现这个骨架本身用Zymo的z competent转化效率就特别低 怀疑是低拷贝质粒
5ul质粒+50ulcompetent也只能长出十来个克隆
可是用这个骨架酶切后与目的基因PCR酶切产物做T4连接后更死活长不出克隆来
请问大家有啥建议？换competent？哪个公司的DH5a转化效率更好些？ |
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s*****i
发帖数: 315 | 37 一般情况下PCR产物切胶回收比直接purify要好得多，也避免了这种杂带的问题
个人经验可以考虑直接三段连，但是不如从质粒上切下来效率高。
可以适当延长PCR产物的酶切时间，因为酶切不完全是导致三段连法连接失败的主要原因 |
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s*****r
发帖数: 11545 | 38 都差不多，只不过这个更直观解释生物分子进程，这个意义更大一点，不过都是母鸡如
何下鸡蛋的问题，吃鸡蛋的人无须过多关心。
: 这个比施一公和彦宁做的东西有意义多了吧？
: ：人类首次拍摄DNA复制！美科学家：人类理论完全瞎编，中学课本错误百出！
: ：2017-06-21 环球科学大观 基因谷
: ：近日，来自美国加利福尼大学的科学家Stephen博士在顶级杂志《Cell》上发
表成果称
: ：，所在团队创奇迹般的摄录了单个DNA分子复制的近距离高清无码影像。事实
证明人类
: ：半个多世纪以来“臆想”的模型是何其错误百出，此发现彻底改写我们高中所
学的生
: 物知识，颠覆了整个科学界！
: ：传统观念中，DNA双螺旋结构由4类不同碱基相互交织成链。在遵循碱基互补配
对原则
: 、半保留复制与半不连续复制等规则的条件下，解旋酶、DNA聚合酶与连接酶等
物质分别
: ：作用于链状结构，使得新产生的遗传物质与母体完全匹配。
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t******r
发帖数: 8600 | 39 11宫做的是什么几把东东？
: 这个比施一公和彦宁做的东西有意义多了吧？
: ：人类首次拍摄DNA复制！美科学家：人类理论完全瞎编，中学课本错误百出！
: ：2017-06-21 环球科学大观 基因谷
: ：近日，来自美国加利福尼大学的科学家Stephen博士在顶级杂志《Cell》上发
表成果称
: ：，所在团队创奇迹般的摄录了单个DNA分子复制的近距离高清无码影像。事实
证明人类
: ：半个多世纪以来“臆想”的模型是何其错误百出，此发现彻底改写我们高中所
学的生
: 物知识，颠覆了整个科学界！
: ：传统观念中，DNA双螺旋结构由4类不同碱基相互交织成链。在遵循碱基互补配
对原则
: 、半保留复制与半不连续复制等规则的条件下，解旋酶、DNA聚合酶与连接酶等
物质分别
: ：作用于链状结构，使得新产生的遗传物质与母体完全匹配。
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x*****e
发帖数: 309 | 40 贴个我的做法吧，成功率很高，供参考。
1、引物退火溶液Annealing buffer: NaCl 100 mM, Hepes 50 mM, pH 7.4
(1ml: NaCl 2M 50ul, HEPES 1M 50ul, 加水至1 ml，pH试纸调pH)
2、引物浓度约=28.3ug/OD, 加入94ul Annealing Buffer 至终浓度 0.3 mg/ml
3、加入上下游引物各10 ul，Annealing Buffer 30 ul，90度4分钟，70度10分钟，然
后放到500 ml装有70度热水的烧杯中，室温冷却后连接或-20度保存。
4、连接质粒，加入2ul退火后的产物，1 ul T4 DNA ligase buffer, 1ul pSR/BglII+
HindIII 线性质粒, 5 ul 水，1 ul T4 Ligase. 连接（16度过夜或室温30－120分钟）。
5、加入1 ul Bgl II 至连接产物中，37度消化30分钟，转化感受态细胞。
6、挑取转换子，提质粒，酶切鉴定，注意阴性克隆切出条带大概1kb（227，248和
281bp条带差异不明显，故对 |
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e***o
发帖数: 344 | 41 切口的产生是因为建库的时候，需要连接一个linker，然后还要连接测序adapter. 为
了避免linker和adapter自连，linker以及连接测序的adapter没有磷酸化。由于切口两
端都是羟基，不能用连接酶连接，切口平移也失效（正义链的切刻和反义链的切刻会在
DNA链中间遇到而使链断裂）。
请各位指教！ |
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r****o
发帖数: 105 | 42 几个小建议：
(1) 去磷酸化不是那么重要。
(2)换新的连接酶尤其是新的BUFFER。连接反应的BUFFER
非常容易坏，因为里面有ATP，冻融几次就不行了。
(3)载体和插入片段的量要足够。建议插入片段的量越多
越好。我一般让片段的莫尔量是载体的几十倍。
(4)既然你用琼脂糖凝胶纯化你的片段。我估计你用UV照射过
胶来确定位置，然后切下有DNA的部分，是吧？UV照射下，
很容易让DNA形成嘧啶二聚体，急剧降低连接效率。所以你要么
不用gel purification，如果必须分离两个片段，你可以
同时在两条LANE上跑少量的DNA和大量的DNA，切下少量DNA的
胶用UV照射确定所要片段的位置。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 43 做个大克隆
用roche SAP + fast liagtion kit
测序发现所有连接产物都是反向连接（一共7个克隆）
请问大家遇到过这种情况么 |
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R***t
发帖数: 100 | 46 有两个短的DNA片段，一个70bp,一个140bp，片段的两端都有黏性酶切位点，我想把它
们连接起来。
请问是否可以直接连接呢？还是需要做overlap extension PCR？
谢谢各位的解答。 |
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m****g
发帖数: 530 | 47 伯纳姆医学研究所Dieter Wolf及其同事选取裂殖酵母(S. pombe)为试验模型，解开了
Fbox蛋白和cullin-RING泛素连接酶
(CRL1)之间复杂的关系——在缺少Fbox的条件下，CRL1既不能与蛋白质底物结合，也不
能引入泛素。
S. pombe 能表达16种不同的Fbox蛋白，COP9信号复合体(COP9 signalosome, CSN)能调
节其中一些Fbox蛋白质的表
达。这项研究表明，Fbox蛋白能与CRL1进行结合，但在竞争性蛋白质CAND1存在的条件
下，CAND1能取代Fbox的位置
并与CRL1结合，当CRL1底物发生降解时，这种竞争性取代才会终止。磷酸化的底物招募
的N8蛋白，这种N8蛋白能够连
接到CRL1复合体上并具有稳定Fbox蛋白的功能，然后该复合体与底物连接并招募泛素。
当该过程结束，N8蛋白去除，
Fbox又趋于不稳定状态，上述过程又重新开始。
据Dr. Wolf介绍，CAND1和Fbox之间的竞争机制能增加Fbox蛋白与CRL1连接的机会。若
没有CAND1存在时，其他类型
的Fbox蛋白将主导该过程。此外，研究人员还发现，凡是与 |
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m**u
发帖数: 3348 | 48 生物就是这么大海捞针 所以说99.9%都是垃圾我也承认
你难道以为一个克隆技术是某个大牛某天晚上一拍脑袋第二天就作出来了？
前期也有几十年的积累 后期还有几十年的完善
各种连接酶内切酶是一两个实验室能搞出来的么？ |
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g******1
发帖数: 244 | 50 不需要线性化，直接在两头引物加两个位点，PCR以后双酶切，或者末端填平磷酸化自
连转化扩增后再双酶切。LA-taq突变率挺高的，建议phusion。 |
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