a******n
发帖数: 392 | 1 做的是胚胎干细胞。有什么讲究的没有，除了用低血清培养液之外？一般都要加什么增加
transduction效率的辅助物质呢？对细胞生长的状况有什么要求？ |
a*****n
发帖数: 2835 | 2 能不能家polybrene？
增加
【在 a******n 的大作中提到】
: 做的是胚胎干细胞。有什么讲究的没有，除了用低血清培养液之外？一般都要加什么增加
: transduction效率的辅助物质呢？对细胞生长的状况有什么要求？
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a******n
发帖数: 392 | |
g******g
发帖数: 63 | |
a******n
发帖数: 392 | 5 你的transduction效率有多高？MOI用多少？
【在 g******g 的大作中提到】
: 偶加polybrene的，但偶用的肝脏瘤母细胞
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g******g
发帖数: 63 | |
B******o
发帖数: 496 | 7 polybrene能显著提高transduction效率的
你用的是human的还是老鼠的ES? 如果是人的话，本来效率就不高（有些literature比
如george daley的完全是忽悠）
【在 a******n 的大作中提到】
: 有些实验方法是说要加这个东西，加不加差别大吗？
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l**********n
发帖数: 240 | 8 细胞膜带负电荷，影响病毒颗粒附着。
polybrene 带正电荷能中和部分细胞膜的电荷，因而能facilitate particle
attachment.
我用lentivirus， （with polybrene）在人血管平滑肌细胞达到70％感染率(assessed
by puromycin resistence)，在大鼠细胞达到30%.
【在 a*****n 的大作中提到】
: 能不能家polybrene？
:
: 增加
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a******n
发帖数: 392 | 9 哪篇文献说过人胚胎干细胞lentivirus transduction的效率问题? 谢了！
【在 B******o 的大作中提到】
: polybrene能显著提高transduction效率的
: 你用的是human的还是老鼠的ES? 如果是人的话，本来效率就不高（有些literature比
: 如george daley的完全是忽悠）
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B******o
发帖数: 496 | 10 pubmed上有不少啊。不过需要注意的是，你的lentiviral vector的promoter最好是EF1
或者PGK的，CMV之类的promoter在hES会被silence掉。所以如果你看到某篇文献用CMV
之类的vector然后讨论说MOI多少的时候效率有多高，基本是忽悠。据俺所致，比如像
su-chun zhang的lab用lentivirus还是需要有建立稳定细胞系的过程
另外，如果要enhance transduction, 除了polybrene，可以再加上spinoculation
【在 a******n 的大作中提到】
: 哪篇文献说过人胚胎干细胞lentivirus transduction的效率问题? 谢了！
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d****i
发帖数: 2346 | 11 你说的promoter的问题有没有参考文献？
我用lentivirus做overexpression怎么都做不出来。但是把plasmid直接转到细胞里面
却可以检测到蛋白的overexpression。
我用的就是CMV promoter。
谢谢！
EF1
CMV
【在 B******o 的大作中提到】
: pubmed上有不少啊。不过需要注意的是，你的lentiviral vector的promoter最好是EF1
: 或者PGK的，CMV之类的promoter在hES会被silence掉。所以如果你看到某篇文献用CMV
: 之类的vector然后讨论说MOI多少的时候效率有多高，基本是忽悠。据俺所致，比如像
: su-chun zhang的lab用lentivirus还是需要有建立稳定细胞系的过程
: 另外，如果要enhance transduction, 除了polybrene，可以再加上spinoculation
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p*******r
发帖数: 4048 | 12 I suggest CMV-chicken beta actin promoter.
CMV is known to be silenced for many situations.
【在 d****i 的大作中提到】
: 你说的promoter的问题有没有参考文献？
: 我用lentivirus做overexpression怎么都做不出来。但是把plasmid直接转到细胞里面
: 却可以检测到蛋白的overexpression。
: 我用的就是CMV promoter。
: 谢谢！
:
: EF1
: CMV
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g******g
发帖数: 63 | 13 偶研究夫人是microRNA的lentiviral vector
GFP是vector的标记蛋白
请问
1.现今有任何方法可以测试细胞中被knock down 或者know in 的microRNA的
expression吗？QRTPCR不行。
2.为什么在转染几周后，GFP的表达和刚刚转染的时候的表达强度下降30%-40%？
谢谢 |
h**********8
发帖数: 650 | 14 Biomicro is right.
The purpose of Lentivirus is to get stable transfected cell line
Ordinary plasmid can get hight expression but is transient.
CMV promoter is virus promoter, cells can silcent it. I get this information
from my boss, but I have not found this paper.
【在 d****i 的大作中提到】
: 你说的promoter的问题有没有参考文献？
: 我用lentivirus做overexpression怎么都做不出来。但是把plasmid直接转到细胞里面
: 却可以检测到蛋白的overexpression。
: 我用的就是CMV promoter。
: 谢谢！
:
: EF1
: CMV
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d****i
发帖数: 2346 | 15 没有文献我没法说服老板。老板也不肯接受我的意见。 |
l******p
发帖数: 787 | 16 兄弟，碰巧干这个我有些经验。就是启动子的问题，参考以下文章
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17348812
顺便说一句，你老板肯定是hES领域的新手吧，老手都知道CMV在hES里面根本没用。
【在 d****i 的大作中提到】
: 你说的promoter的问题有没有参考文献？
: 我用lentivirus做overexpression怎么都做不出来。但是把plasmid直接转到细胞里面
: 却可以检测到蛋白的overexpression。
: 我用的就是CMV promoter。
: 谢谢！
:
: EF1
: CMV
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l******p
发帖数: 787 | 17 拿这个给他看看
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17348812
【在 d****i 的大作中提到】
: 没有文献我没法说服老板。老板也不肯接受我的意见。
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n********k
发帖数: 2818 | 18 CMV is notorious for its silencing in ES and actually many promoters are
somewhat silenced in stem cells... and different lines/cell types are quite
different when come to which promoter to use...
【在 l******p 的大作中提到】
: 拿这个给他看看
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17348812
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a******n
发帖数: 392 | 19 要表达shRNA是不是一定要U6或者H1这种type III RNA polymerase promoter? |
d****i
发帖数: 2346 | 20 非常感谢！
1）现在知道的CMV promoter都在哪些细胞系里面会被silenced？
2）另外，这种silence是CMV promoter自身的问题还是lentivirus的问题？是不是在retrovirus载体里也存在这种现象？
【在 l******p 的大作中提到】
: 兄弟，碰巧干这个我有些经验。就是启动子的问题，参考以下文章
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17348812
: 顺便说一句，你老板肯定是hES领域的新手吧，老手都知道CMV在hES里面根本没用。
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d****i
发帖数: 2346 | 21 不一定。
xia haibin好像最早用了CMV promoter。现在陕西师大建了实验室。
还有就是如果你把你的shRNA涉及到内含子里面，转录后自动剪切，那么前面可以随便
用那种启动子。
【在 a******n 的大作中提到】
: 要表达shRNA是不是一定要U6或者H1这种type III RNA polymerase promoter?
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