m****m 发帖数: 395 | 1 我每次做SDSPAGE胶都很紧张,尽管动作已经非常快了,7.94ML的分离胶溶液要一次性
同时做完两块胶,就是做不好,做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。
下面是我的配方,大家看看哦
1.9ML 49.5% AABis
2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5)
2.67ml glycerol:H20(56:44)
0.7ML H20
APS(10%) 80ul
TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul,还是来不及)
(这个分离胶水封后,我看基本5分钟多点就完全凝住了)
首先,溶液我肯定仔细混匀了,然后我用这点溶液分别加到两块胶板的刻度线上,加完
一块,加另一块,基本正好用完这点,期间动作非常快的。然后轻轻地加水,为了使其
平整,因为要加两块,总是让其中一块要等一会,加水的时候我不敢用力,因为会让胶
起伏造成不平整,也是按先前的顺序加先注胶的那块,然后再给另一块加水。但是不知
道为什么就是掌握不好,做到最后两块都不是很平整,要不就是大波浪型,要不就是虽
然直了但是是斜的,觉得还是加水的时候胶已经开始凝了。
为了做好 |
m****m 发帖数: 395 | 2 歪的胶跑出来的条带就不可信了,所以我一定要做好。
但是我不想每次一做胶就很紧张,可不可以从容地、对速度要求不那么高的情况下做完
啊?
配方要怎么改一下吗? |
p*3 发帖数: 45 | 3 8ul TEMED for 8ml gel is more than enough |
a********k 发帖数: 2273 | 4 你的id真工整,让我觉得是my mm yammy的缩写
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我每次做SDSPAGE胶都很紧张,尽管动作已经非常快了,7.94ML的分离胶溶液要一次性 : 同时做完两块胶,就是做不好,做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。 : 下面是我的配方,大家看看哦 : 1.9ML 49.5% AABis : 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5) : 2.67ml glycerol:H20(56:44) : 0.7ML H20 : APS(10%) 80ul : TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul,还是来不及) : (这个分离胶水封后,我看基本5分钟多点就完全凝住了)
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m****m 发帖数: 395 | 5 是吗?
【在 p*3 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 8ul TEMED for 8ml gel is more than enough
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m****m 发帖数: 395 | 6 ^_^ 我是女生啦。这个只是我名字首字母的缩写,重复,而已。别歪楼
【在 a********k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你的id真工整,让我觉得是my mm yammy的缩写
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q******g 发帖数: 3858 | |
w******x 发帖数: 252 | |
a***a 发帖数: 40617 | 9 aps 80ul
temed 8ul
足够了
你这个16ul改13ul太鸵鸟了。。。
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我每次做SDSPAGE胶都很紧张,尽管动作已经非常快了,7.94ML的分离胶溶液要一次性 : 同时做完两块胶,就是做不好,做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。 : 下面是我的配方,大家看看哦 : 1.9ML 49.5% AABis : 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5) : 2.67ml glycerol:H20(56:44) : 0.7ML H20 : APS(10%) 80ul : TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul,还是来不及) : (这个分离胶水封后,我看基本5分钟多点就完全凝住了)
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a****o 发帖数: 1786 | 10 我碰到这种问题,肯定APS,TEMED各减半先
我以前都用异丙醇压平
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我每次做SDSPAGE胶都很紧张,尽管动作已经非常快了,7.94ML的分离胶溶液要一次性 : 同时做完两块胶,就是做不好,做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。 : 下面是我的配方,大家看看哦 : 1.9ML 49.5% AABis : 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5) : 2.67ml glycerol:H20(56:44) : 0.7ML H20 : APS(10%) 80ul : TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul,还是来不及) : (这个分离胶水封后,我看基本5分钟多点就完全凝住了)
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y***k 发帖数: 60 | 11 temed用量减半
如果胶还是不平,可以改用乙醇封
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我每次做SDSPAGE胶都很紧张,尽管动作已经非常快了,7.94ML的分离胶溶液要一次性 : 同时做完两块胶,就是做不好,做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。 : 下面是我的配方,大家看看哦 : 1.9ML 49.5% AABis : 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5) : 2.67ml glycerol:H20(56:44) : 0.7ML H20 : APS(10%) 80ul : TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul,还是来不及) : (这个分离胶水封后,我看基本5分钟多点就完全凝住了)
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h******y 发帖数: 1374 | |
p******i 发帖数: 1092 | 13 amedio說的沒錯,肯定APS,TEMED各减半先……不過可能要等很長時間……
我用0.1%SDS封膠的,就是在兩邊各加一點就好了……
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我每次做SDSPAGE胶都很紧张,尽管动作已经非常快了,7.94ML的分离胶溶液要一次性 : 同时做完两块胶,就是做不好,做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。 : 下面是我的配方,大家看看哦 : 1.9ML 49.5% AABis : 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5) : 2.67ml glycerol:H20(56:44) : 0.7ML H20 : APS(10%) 80ul : TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul,还是来不及) : (这个分离胶水封后,我看基本5分钟多点就完全凝住了)
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b******n 发帖数: 4225 | 14 泣血飘过……
【在 h******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 现在还有自己做胶的呀?
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m****m 发帖数: 395 | |
M*****n 发帖数: 16729 | 16 如果是每天跑十几块胶的,买现成的恐怕很费钱哦,除非大老板,小老板负担不起的。
如果每天一两块胶,还是买现成划算。你每小时的人工就超过一块胶了。
【在 b******n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 泣血飘过……
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W****C 发帖数: 1937 | 17
从来没听说过用乙醇封的。。。。挥发了吧。。。。用水封多简单啊
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : APS也要减量吗? : 可以用乙醇封?
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e**e 发帖数: 166 | |
h********n 发帖数: 4079 | 19 买胶, 一定要买.
自从我用上买的胶, western水平大大提高, 哇咔咔咔咔 |
a***a 发帖数: 40617 | 20 没实际区别
【在 e**e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 上面不加水压 用 isopropanol
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a***a 发帖数: 40617 | 21 ft。。。现在都这么二把刀吗?
先搞清楚为啥要封
【在 W****C 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : 从来没听说过用乙醇封的。。。。挥发了吧。。。。用水封多简单啊
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h********n 发帖数: 4079 | 22 EtOH封挺好的啊, 有问题吗?
【在 W****C 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : : 从来没听说过用乙醇封的。。。。挥发了吧。。。。用水封多简单啊
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l*****o 发帖数: 26631 | 23 我就是用乙醇封的, 下面胶凝了以后把乙醇倒掉,吸干,微量残留的还能挥发掉,挺
好啊。 |
j*********n 发帖数: 168 | 24 呵呵,用水能封住么?
你配的胶液里没水么?
有水的话,此水和彼水有什么差别么?
我在国内用异丙醇封胶,只加一点,略微能盖过分离胶就好。等加浓缩胶的时候,把异
丙醇倒掉,用蒸馏水冲洗一下,干了就可以加浓缩胶了。
在美国实验室,直接用100%乙醇封,就直接用洗瓶加满,也是等分离胶凝固了,倒掉乙
醇,挥发干净了再加浓缩胶。
凝得快肯定是他妈的(TEMED)加多了,我先后做过DGGE,SDS-PAGE,Urea PAGE,AP的量不是很重要,主要还是他妈的。
你试试减一下量,应该能解决。
又及:查了一下实验室protocol,我们一次配4 pieces,20ML胶液,加了8UL他妈的。
或者你可以参考一下比例。一般不到半小时就可以凝胶了…… |
s***e 发帖数: 793 | 25 有次temed加多了,胶就凝在枪头里了
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我每次做SDSPAGE胶都很紧张,尽管动作已经非常快了,7.94ML的分离胶溶液要一次性 : 同时做完两块胶,就是做不好,做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。 : 下面是我的配方,大家看看哦 : 1.9ML 49.5% AABis : 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5) : 2.67ml glycerol:H20(56:44) : 0.7ML H20 : APS(10%) 80ul : TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul,还是来不及) : (这个分离胶水封后,我看基本5分钟多点就完全凝住了)
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c****k 发帖数: 13 | 26 为啥不直接买好了,10块钱一胶,拿来直接用
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我每次做SDSPAGE胶都很紧张,尽管动作已经非常快了,7.94ML的分离胶溶液要一次性 : 同时做完两块胶,就是做不好,做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。 : 下面是我的配方,大家看看哦 : 1.9ML 49.5% AABis : 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5) : 2.67ml glycerol:H20(56:44) : 0.7ML H20 : APS(10%) 80ul : TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul,还是来不及) : (这个分离胶水封后,我看基本5分钟多点就完全凝住了)
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b******n 发帖数: 4225 | 27 LZ在做EMSA?
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我每次做SDSPAGE胶都很紧张,尽管动作已经非常快了,7.94ML的分离胶溶液要一次性 : 同时做完两块胶,就是做不好,做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。 : 下面是我的配方,大家看看哦 : 1.9ML 49.5% AABis : 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5) : 2.67ml glycerol:H20(56:44) : 0.7ML H20 : APS(10%) 80ul : TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul,还是来不及) : (这个分离胶水封后,我看基本5分钟多点就完全凝住了)
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s**e 发帖数: 1523 | |
T**********t 发帖数: 1604 | 29 我配10ml的胶只用4ul的TEMED就够了。
上面用水饱和的正丁醇封。
APS一定要新鲜配,我发现哪怕是放-20度保存的APS也没有新鲜配的好用。 |
T**********t 发帖数: 1604 | 30 用水/乙醇/异丙醇封胶都可能会使分离胶表面的局部胶浓度发生变化。水饱和的正丁醇
因为不能够再吸收水分,所以应该是最适合封胶用的。不过我也用水封过胶,貌似没看
出太大影响。 |
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T**********t 发帖数: 1604 | 31 用水能封住。
我用水封了好几年的胶都没问题呢。最近rp有点低落,胶表面也偶然出现不太工整的情
况,才重新开始用水饱和正丁醇封的。
封胶就是为了隔绝空气嘛。混好的胶溶液的密度比水大很多,只要加水的时候小心一点
,不至于混得太厉害,分层还是很明显的。
量不是很重要,主要还是他妈的。
【在 j*********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 呵呵,用水能封住么? : 你配的胶液里没水么? : 有水的话,此水和彼水有什么差别么? : 我在国内用异丙醇封胶,只加一点,略微能盖过分离胶就好。等加浓缩胶的时候,把异 : 丙醇倒掉,用蒸馏水冲洗一下,干了就可以加浓缩胶了。 : 在美国实验室,直接用100%乙醇封,就直接用洗瓶加满,也是等分离胶凝固了,倒掉乙 : 醇,挥发干净了再加浓缩胶。 : 凝得快肯定是他妈的(TEMED)加多了,我先后做过DGGE,SDS-PAGE,Urea PAGE,AP的量不是很重要,主要还是他妈的。 : 你试试减一下量,应该能解决。 : 又及:查了一下实验室protocol,我们一次配4 pieces,20ML胶液,加了8UL他妈的。
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a***e 发帖数: 1010 | 32 APS solution can be stored at 4oC for 1 month.
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我配10ml的胶只用4ul的TEMED就够了。 : 上面用水饱和的正丁醇封。 : APS一定要新鲜配,我发现哪怕是放-20度保存的APS也没有新鲜配的好用。
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T**********t 发帖数: 1604 | 33 我以前是分装了放-20。
有时候忘记收起来,放室温一个礼拜,偷懒拿来直接用也没关系。
但是每次rp不好胶凝得难看了一点的时候,新鲜配的APS总是好过冰箱里拿出来的。
【在 a***e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : APS solution can be stored at 4oC for 1 month.
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C*******e 发帖数: 4348 | 34 前两条赞同
APS新不新鲜没关系,越新鲜凝得越快
我们以前实验室APS配好了放室温都能用一个月
就是慢一点
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我配10ml的胶只用4ul的TEMED就够了。 : 上面用水饱和的正丁醇封。 : APS一定要新鲜配,我发现哪怕是放-20度保存的APS也没有新鲜配的好用。
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k****o 发帖数: 589 | 35 减少APS或者TEMED的量,自己把握。用水,丁醇,乙醇,异丙醇封都行。APS无所谓,
我放三个多月了照样用得开心。做胶的时候没什么好紧张的,不好重新灌就是了,便宜
。只是注意千万不要沾有害物质了。一旦你灌习惯了,反而不喜欢用现成的胶。我用自
己的胶跑出来的效果比直接买的好不少。 |
s********n 发帖数: 2939 | |
y****2 发帖数: 1601 | 37 把所有溶液都放4C储存,这样凝的就不会那么快了 |
a****d 发帖数: 1919 | 38 来这边后从来没配过胶,都忘了。。。
偶用的是invitrogen的预制胶,效果挺好的 |
n******d 发帖数: 1055 | 39 it is not necessary to use SDS and Glycerol in the gels.
use 1/100 of 10% APS, use 1/1000 TEMED, Use water to seal resolving gel. it
take ~7min to polymerize (yes, it is so reproducible) |
b*******H 发帖数: 830 | 40 看来楼主对做凝胶的原理一点都不明白。那就是个链式反应。少用点TEMED什么问题都
解决了。根据个人的操作熟练程度而定。另外用正丁醇封胶是标准方法,去泡,均匀,
其他都是歪门邪道。
俺喜欢自己做,每天八块,想用什么样的随便做。 |
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c*****n 发帖数: 10 | 41 查一下Bio-Rad的指南吧。他们的Hand cast 有很详细的说明。 |
s******g 发帖数: 111 | 42 TEMED 16ul 太多了,我看4ul都足以了。 |
d*********s 发帖数: 390 | 43 10%APS: 40ul
TEMED 4ul
我用水饱和的1-Butanol 封胶的 |
d*********s 发帖数: 390 | 44 10%APS: 40ul
TEMED 4ul
我用水饱和的1-Butanol 封胶的 |
n******d 发帖数: 1055 | 45 用水是可以的,你试试就知道了
量不是很重要,主要还是他妈的。
【在 j*********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 呵呵,用水能封住么? : 你配的胶液里没水么? : 有水的话,此水和彼水有什么差别么? : 我在国内用异丙醇封胶,只加一点,略微能盖过分离胶就好。等加浓缩胶的时候,把异 : 丙醇倒掉,用蒸馏水冲洗一下,干了就可以加浓缩胶了。 : 在美国实验室,直接用100%乙醇封,就直接用洗瓶加满,也是等分离胶凝固了,倒掉乙 : 醇,挥发干净了再加浓缩胶。 : 凝得快肯定是他妈的(TEMED)加多了,我先后做过DGGE,SDS-PAGE,Urea PAGE,AP的量不是很重要,主要还是他妈的。 : 你试试减一下量,应该能解决。 : 又及:查了一下实验室protocol,我们一次配4 pieces,20ML胶液,加了8UL他妈的。
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r*****8 发帖数: 2560 | 46 同意,我也都试过,看不出任何不同。
【在 T**********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用水/乙醇/异丙醇封胶都可能会使分离胶表面的局部胶浓度发生变化。水饱和的正丁醇 : 因为不能够再吸收水分,所以应该是最适合封胶用的。不过我也用水封过胶,貌似没看 : 出太大影响。
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s*******c 发帖数: 192 | 47 APS量不需要变,量少的话会不凝。最好现配防止降解。
建议认真看一下SDS PAGE的原理。。。。凝胶的化学反应中,APS相当于反应物,TEMED
相当于催化剂
乙醇封?没必要吧。。。加点水封就成了,或者那位介绍下乙醇有什么特别的好处么?
难道是乙醇等胶凝了就挥发了省的吸水?
【在 m****m 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : APS也要减量吗? : 可以用乙醇封?
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s*******c 发帖数: 192 | 48 亲身体验,有次APS加少了(后来发现是配溶液水加多了,我一般就看着小离心管刻度加
点,结果刻度看错了...)等了一下午都没凝。。。。
凝胶速度主要是TEMED
【在 p******i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : amedio說的沒錯,肯定APS,TEMED各减半先……不過可能要等很長時間…… : 我用0.1%SDS封膠的,就是在兩邊各加一點就好了……
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