m****m
发帖数: 395 | 1 我每次做SDSPAGE胶都很紧张，尽管动作已经非常快了，7.94ML的分离胶溶液要一次性
同时做完两块胶，就是做不好，做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。
下面是我的配方，大家看看哦
1.9ML 49.5% AABis
2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5)
2.67ml glycerol:H20(56:44)
0.7ML H20
APS(10%) 80ul
TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul，还是来不及)
（这个分离胶水封后，我看基本5分钟多点就完全凝住了）
首先，溶液我肯定仔细混匀了，然后我用这点溶液分别加到两块胶板的刻度线上，加完
一块，加另一块，基本正好用完这点，期间动作非常快的。然后轻轻地加水，为了使其
平整，因为要加两块，总是让其中一块要等一会，加水的时候我不敢用力，因为会让胶
起伏造成不平整，也是按先前的顺序加先注胶的那块，然后再给另一块加水。但是不知
道为什么就是掌握不好，做到最后两块都不是很平整，要不就是大波浪型，要不就是虽
然直了但是是斜的，觉得还是加水的时候胶已经开始凝了。
为了做好 |
m****m
发帖数: 395 | 2 歪的胶跑出来的条带就不可信了，所以我一定要做好。
但是我不想每次一做胶就很紧张，可不可以从容地、对速度要求不那么高的情况下做完
啊？
配方要怎么改一下吗？ |
p*3
发帖数: 45 | 3 8ul TEMED for 8ml gel is more than enough |
a********k
发帖数: 2273 | 4 你的id真工整，让我觉得是my mm yammy的缩写
【在 m****m 的大作中提到】
: 我每次做SDSPAGE胶都很紧张，尽管动作已经非常快了，7.94ML的分离胶溶液要一次性
: 同时做完两块胶，就是做不好，做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。
: 下面是我的配方，大家看看哦
: 1.9ML 49.5% AABis
: 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5)
: 2.67ml glycerol:H20(56:44)
: 0.7ML H20
: APS(10%) 80ul
: TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul，还是来不及)
: （这个分离胶水封后，我看基本5分钟多点就完全凝住了）
|
m****m
发帖数: 395 | 5 是吗？
【在 p*3 的大作中提到】
: 8ul TEMED for 8ml gel is more than enough
|
m****m
发帖数: 395 | 6 ^_^ 我是女生啦。这个只是我名字首字母的缩写，重复，而已。别歪楼
【在 a********k 的大作中提到】
: 你的id真工整，让我觉得是my mm yammy的缩写
|
q******g
发帖数: 3858 | |
w******x
发帖数: 252 | |
a***a
发帖数: 40617 | 9 aps 80ul
temed 8ul
足够了
你这个16ul改13ul太鸵鸟了。。。
【在 m****m 的大作中提到】
: 我每次做SDSPAGE胶都很紧张，尽管动作已经非常快了，7.94ML的分离胶溶液要一次性
: 同时做完两块胶，就是做不好，做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。
: 下面是我的配方，大家看看哦
: 1.9ML 49.5% AABis
: 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5)
: 2.67ml glycerol:H20(56:44)
: 0.7ML H20
: APS(10%) 80ul
: TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul，还是来不及)
: （这个分离胶水封后，我看基本5分钟多点就完全凝住了）
|
a****o
发帖数: 1786 | 10 我碰到这种问题，肯定APS，TEMED各减半先
我以前都用异丙醇压平
【在 m****m 的大作中提到】
: 我每次做SDSPAGE胶都很紧张，尽管动作已经非常快了，7.94ML的分离胶溶液要一次性
: 同时做完两块胶，就是做不好，做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。
: 下面是我的配方，大家看看哦
: 1.9ML 49.5% AABis
: 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5)
: 2.67ml glycerol:H20(56:44)
: 0.7ML H20
: APS(10%) 80ul
: TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul，还是来不及)
: （这个分离胶水封后，我看基本5分钟多点就完全凝住了）
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y***k
发帖数: 60 | 11 temed用量减半
如果胶还是不平，可以改用乙醇封
【在 m****m 的大作中提到】
: 我每次做SDSPAGE胶都很紧张，尽管动作已经非常快了，7.94ML的分离胶溶液要一次性
: 同时做完两块胶，就是做不好，做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。
: 下面是我的配方，大家看看哦
: 1.9ML 49.5% AABis
: 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5)
: 2.67ml glycerol:H20(56:44)
: 0.7ML H20
: APS(10%) 80ul
: TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul，还是来不及)
: （这个分离胶水封后，我看基本5分钟多点就完全凝住了）
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h******y
发帖数: 1374 | |
p******i
发帖数: 1092 | 13 amedio說的沒錯，肯定APS，TEMED各减半先……不過可能要等很長時間……
我用0.1%SDS封膠的，就是在兩邊各加一點就好了……
【在 m****m 的大作中提到】
: 我每次做SDSPAGE胶都很紧张，尽管动作已经非常快了，7.94ML的分离胶溶液要一次性
: 同时做完两块胶，就是做不好，做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。
: 下面是我的配方，大家看看哦
: 1.9ML 49.5% AABis
: 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5)
: 2.67ml glycerol:H20(56:44)
: 0.7ML H20
: APS(10%) 80ul
: TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul，还是来不及)
: （这个分离胶水封后，我看基本5分钟多点就完全凝住了）
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b******n
发帖数: 4225 | 14 泣血飘过……
【在 h******y 的大作中提到】
: 现在还有自己做胶的呀？
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m****m
发帖数: 395 | |
M*****n
发帖数: 16729 | 16 如果是每天跑十几块胶的，买现成的恐怕很费钱哦，除非大老板，小老板负担不起的。
如果每天一两块胶，还是买现成划算。你每小时的人工就超过一块胶了。
【在 b******n 的大作中提到】
: 泣血飘过……
|
W****C
发帖数: 1937 | 17
从来没听说过用乙醇封的。。。。挥发了吧。。。。用水封多简单啊
【在 m****m 的大作中提到】
: APS也要减量吗？
: 可以用乙醇封？
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e**e
发帖数: 166 | |
h********n
发帖数: 4079 | 19 买胶, 一定要买.
自从我用上买的胶, western水平大大提高, 哇咔咔咔咔 |
a***a
发帖数: 40617 | 20 没实际区别
【在 e**e 的大作中提到】
: 上面不加水压 用 isopropanol
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a***a
发帖数: 40617 | 21 ft。。。现在都这么二把刀吗？
先搞清楚为啥要封
【在 W****C 的大作中提到】
:
: 从来没听说过用乙醇封的。。。。挥发了吧。。。。用水封多简单啊
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h********n
发帖数: 4079 | 22 EtOH封挺好的啊, 有问题吗?
【在 W****C 的大作中提到】
:
: 从来没听说过用乙醇封的。。。。挥发了吧。。。。用水封多简单啊
|
l*****o
发帖数: 26631 | 23 我就是用乙醇封的， 下面胶凝了以后把乙醇倒掉，吸干，微量残留的还能挥发掉，挺
好啊。 |
j*********n
发帖数: 168 | 24 呵呵，用水能封住么？
你配的胶液里没水么？
有水的话，此水和彼水有什么差别么？
我在国内用异丙醇封胶，只加一点，略微能盖过分离胶就好。等加浓缩胶的时候，把异
丙醇倒掉，用蒸馏水冲洗一下，干了就可以加浓缩胶了。
在美国实验室，直接用100%乙醇封，就直接用洗瓶加满，也是等分离胶凝固了，倒掉乙
醇，挥发干净了再加浓缩胶。
凝得快肯定是他妈的（TEMED)加多了，我先后做过DGGE，SDS-PAGE，Urea PAGE,AP的量不是很重要，主要还是他妈的。
你试试减一下量，应该能解决。
又及：查了一下实验室protocol，我们一次配4 pieces，20ML胶液，加了8UL他妈的。
或者你可以参考一下比例。一般不到半小时就可以凝胶了…… |
s***e
发帖数: 793 | 25 有次temed加多了，胶就凝在枪头里了
【在 m****m 的大作中提到】
: 我每次做SDSPAGE胶都很紧张，尽管动作已经非常快了，7.94ML的分离胶溶液要一次性
: 同时做完两块胶，就是做不好，做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。
: 下面是我的配方，大家看看哦
: 1.9ML 49.5% AABis
: 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5)
: 2.67ml glycerol:H20(56:44)
: 0.7ML H20
: APS(10%) 80ul
: TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul，还是来不及)
: （这个分离胶水封后，我看基本5分钟多点就完全凝住了）
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c****k
发帖数: 13 | 26 为啥不直接买好了，10块钱一胶，拿来直接用
【在 m****m 的大作中提到】
: 我每次做SDSPAGE胶都很紧张，尽管动作已经非常快了，7.94ML的分离胶溶液要一次性
: 同时做完两块胶，就是做不好，做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。
: 下面是我的配方，大家看看哦
: 1.9ML 49.5% AABis
: 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5)
: 2.67ml glycerol:H20(56:44)
: 0.7ML H20
: APS(10%) 80ul
: TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul，还是来不及)
: （这个分离胶水封后，我看基本5分钟多点就完全凝住了）
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b******n
发帖数: 4225 | 27 LZ在做EMSA?
【在 m****m 的大作中提到】
: 我每次做SDSPAGE胶都很紧张，尽管动作已经非常快了，7.94ML的分离胶溶液要一次性
: 同时做完两块胶，就是做不好，做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。
: 下面是我的配方，大家看看哦
: 1.9ML 49.5% AABis
: 2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5)
: 2.67ml glycerol:H20(56:44)
: 0.7ML H20
: APS(10%) 80ul
: TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul，还是来不及)
: （这个分离胶水封后，我看基本5分钟多点就完全凝住了）
|
s**e
发帖数: 1523 | |
T**********t
发帖数: 1604 | 29 我配10ml的胶只用4ul的TEMED就够了。
上面用水饱和的正丁醇封。
APS一定要新鲜配，我发现哪怕是放-20度保存的APS也没有新鲜配的好用。 |
T**********t
发帖数: 1604 | 30 用水/乙醇/异丙醇封胶都可能会使分离胶表面的局部胶浓度发生变化。水饱和的正丁醇
因为不能够再吸收水分，所以应该是最适合封胶用的。不过我也用水封过胶，貌似没看
出太大影响。 |
|
|
T**********t
发帖数: 1604 | 31 用水能封住。
我用水封了好几年的胶都没问题呢。最近rp有点低落，胶表面也偶然出现不太工整的情
况，才重新开始用水饱和正丁醇封的。
封胶就是为了隔绝空气嘛。混好的胶溶液的密度比水大很多，只要加水的时候小心一点
，不至于混得太厉害，分层还是很明显的。
量不是很重要，主要还是他妈的。
【在 j*********n 的大作中提到】
: 呵呵，用水能封住么？
: 你配的胶液里没水么？
: 有水的话，此水和彼水有什么差别么？
: 我在国内用异丙醇封胶，只加一点，略微能盖过分离胶就好。等加浓缩胶的时候，把异
: 丙醇倒掉，用蒸馏水冲洗一下，干了就可以加浓缩胶了。
: 在美国实验室，直接用100%乙醇封，就直接用洗瓶加满，也是等分离胶凝固了，倒掉乙
: 醇，挥发干净了再加浓缩胶。
: 凝得快肯定是他妈的（TEMED)加多了，我先后做过DGGE，SDS-PAGE，Urea PAGE,AP的量不是很重要，主要还是他妈的。
: 你试试减一下量，应该能解决。
: 又及：查了一下实验室protocol，我们一次配4 pieces，20ML胶液，加了8UL他妈的。
|
a***e
发帖数: 1010 | 32 APS solution can be stored at 4oC for 1 month.
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我配10ml的胶只用4ul的TEMED就够了。
: 上面用水饱和的正丁醇封。
: APS一定要新鲜配，我发现哪怕是放-20度保存的APS也没有新鲜配的好用。
|
T**********t
发帖数: 1604 | 33 我以前是分装了放-20。
有时候忘记收起来，放室温一个礼拜，偷懒拿来直接用也没关系。
但是每次rp不好胶凝得难看了一点的时候，新鲜配的APS总是好过冰箱里拿出来的。
【在 a***e 的大作中提到】
: APS solution can be stored at 4oC for 1 month.
|
C*******e
发帖数: 4348 | 34 前两条赞同
APS新不新鲜没关系，越新鲜凝得越快
我们以前实验室APS配好了放室温都能用一个月
就是慢一点
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我配10ml的胶只用4ul的TEMED就够了。
: 上面用水饱和的正丁醇封。
: APS一定要新鲜配，我发现哪怕是放-20度保存的APS也没有新鲜配的好用。
|
k****o
发帖数: 589 | 35 减少APS或者TEMED的量，自己把握。用水，丁醇，乙醇，异丙醇封都行。APS无所谓，
我放三个多月了照样用得开心。做胶的时候没什么好紧张的，不好重新灌就是了，便宜
。只是注意千万不要沾有害物质了。一旦你灌习惯了，反而不喜欢用现成的胶。我用自
己的胶跑出来的效果比直接买的好不少。 |
s********n
发帖数: 2939 | |
y****2
发帖数: 1601 | 37 把所有溶液都放4C储存，这样凝的就不会那么快了 |
a****d
发帖数: 1919 | 38 来这边后从来没配过胶，都忘了。。。
偶用的是invitrogen的预制胶，效果挺好的 |
n******d
发帖数: 1055 | 39 it is not necessary to use SDS and Glycerol in the gels.
use 1/100 of 10% APS, use 1/1000 TEMED, Use water to seal resolving gel. it
take ~7min to polymerize (yes, it is so reproducible) |
b*******H
发帖数: 830 | 40 看来楼主对做凝胶的原理一点都不明白。那就是个链式反应。少用点TEMED什么问题都
解决了。根据个人的操作熟练程度而定。另外用正丁醇封胶是标准方法，去泡，均匀，
其他都是歪门邪道。
俺喜欢自己做，每天八块，想用什么样的随便做。 |
|
|
c*****n
发帖数: 10 | 41 查一下Bio-Rad的指南吧。他们的Hand cast 有很详细的说明。 |
s******g
发帖数: 111 | 42 TEMED 16ul 太多了，我看4ul都足以了。 |
d*********s
发帖数: 390 | 43 10%APS: 40ul
TEMED 4ul
我用水饱和的1-Butanol 封胶的 |
d*********s
发帖数: 390 | 44 10%APS: 40ul
TEMED 4ul
我用水饱和的1-Butanol 封胶的 |
n******d
发帖数: 1055 | 45 用水是可以的，你试试就知道了
量不是很重要，主要还是他妈的。
【在 j*********n 的大作中提到】
: 呵呵，用水能封住么？
: 你配的胶液里没水么？
: 有水的话，此水和彼水有什么差别么？
: 我在国内用异丙醇封胶，只加一点，略微能盖过分离胶就好。等加浓缩胶的时候，把异
: 丙醇倒掉，用蒸馏水冲洗一下，干了就可以加浓缩胶了。
: 在美国实验室，直接用100%乙醇封，就直接用洗瓶加满，也是等分离胶凝固了，倒掉乙
: 醇，挥发干净了再加浓缩胶。
: 凝得快肯定是他妈的（TEMED)加多了，我先后做过DGGE，SDS-PAGE，Urea PAGE,AP的量不是很重要，主要还是他妈的。
: 你试试减一下量，应该能解决。
: 又及：查了一下实验室protocol，我们一次配4 pieces，20ML胶液，加了8UL他妈的。
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r*****8
发帖数: 2560 | 46 同意，我也都试过，看不出任何不同。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 用水/乙醇/异丙醇封胶都可能会使分离胶表面的局部胶浓度发生变化。水饱和的正丁醇
: 因为不能够再吸收水分，所以应该是最适合封胶用的。不过我也用水封过胶，貌似没看
: 出太大影响。
|
s*******c
发帖数: 192 | 47 APS量不需要变，量少的话会不凝。最好现配防止降解。
建议认真看一下SDS PAGE的原理。。。。凝胶的化学反应中，APS相当于反应物，TEMED
相当于催化剂
乙醇封？没必要吧。。。加点水封就成了，或者那位介绍下乙醇有什么特别的好处么？
难道是乙醇等胶凝了就挥发了省的吸水？
【在 m****m 的大作中提到】
: APS也要减量吗？
: 可以用乙醇封？
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s*******c
发帖数: 192 | 48 亲身体验，有次APS加少了(后来发现是配溶液水加多了，我一般就看着小离心管刻度加
点，结果刻度看错了...)等了一下午都没凝。。。。
凝胶速度主要是TEMED
【在 p******i 的大作中提到】
: amedio說的沒錯，肯定APS，TEMED各减半先……不過可能要等很長時間……
: 我用0.1%SDS封膠的，就是在兩邊各加一點就好了……
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