m**i
发帖数: 47 | 1 我老板让我用PCR做出10mg 600bp的DNA, 不许用养细菌的办法提质粒再切。我目前最多
能得到3ug/50ul PCR reaction, 离10mg也差太远了。各位有什么好办法吗？多谢多谢
了!!! |
v*******a
发帖数: 759 | |
a***e
发帖数: 1010 | 3 (1) after cycle 30, stop your PCR, add fresh dTNP and Taq, run another 10
cycles.
(2) use PCR clean up, but not gel purify.
(3) just more reactions. |
m**i
发帖数: 47 | 4 多谢指教!!因为PCR product之后要做digestion和ligation, 那PCR clean up如果用
kit的话也要好几百个了吧.还是用phenol/chloroform去protein,或者还有什么更方便
快捷的办法去掉taq和dNTP呢? |
a***e
发帖数: 1010 | 5 for Taq and dNTP, phenol/chloroform is enough. Problem here is your primers
. |
m**i
发帖数: 47 | 6 Many Thanks! My Primers are biotin-labeled,so I am not too worried about it. |
l***y
发帖数: 638 | 7 找几口水浴，也就是坐着2小时，时不时挪一挪管子
【在 m**i 的大作中提到】
: 我老板让我用PCR做出10mg 600bp的DNA, 不许用养细菌的办法提质粒再切。我目前最多
: 能得到3ug/50ul PCR reaction, 离10mg也差太远了。各位有什么好办法吗？多谢多谢
: 了!!!
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p******i
发帖数: 1092 | 8 好冷
【在 l***y 的大作中提到】
: 找几口水浴，也就是坐着2小时，时不时挪一挪管子
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p******i
发帖数: 1092 | 9 請問能解釋一下為啥不能養細菌嗎？甲基化？
【在 m**i 的大作中提到】
: 我老板让我用PCR做出10mg 600bp的DNA, 不许用养细菌的办法提质粒再切。我目前最多
: 能得到3ug/50ul PCR reaction, 离10mg也差太远了。各位有什么好办法吗？多谢多谢
: 了!!!
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n**8
发帖数: 221 | 10 That is what ppl did before the PCR machine was invented.
It worked very well!
【在 p******i 的大作中提到】
: 好冷
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k*******s
发帖数: 214 | 11 多做些，30管就有了。
【在 m**i 的大作中提到】
: 我老板让我用PCR做出10mg 600bp的DNA, 不许用养细菌的办法提质粒再切。我目前最多
: 能得到3ug/50ul PCR reaction, 离10mg也差太远了。各位有什么好办法吗？多谢多谢
: 了!!!
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p******i
发帖数: 1092 | 12 i used to use this kind of machine...
【在 n**8 的大作中提到】
: That is what ppl did before the PCR machine was invented.
: It worked very well!
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m**i
发帖数: 47 | 13 其实我们以前就是养细菌来做的，4L LB大概最后能拿到200ug的样子。老板觉得太没效
率。
看来也只有多做PCR这样子了，老板希望能把PCR optimize到尽量高。让我加
pyrophosphatase进去，除掉PPi, 拉动正反应。听起来不错，结果一做就有high-
molecular weight product生成。不知道有没有人用过呢？
【在 p******i 的大作中提到】
: 請問能解釋一下為啥不能養細菌嗎？甲基化？
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