r******m
发帖数: 5550 | 1 因为要detect的protein浓度比较小，所以每个sample都要上没有稀释过的5 ul mouse
serum. 这让sample狠粘，跑出来的条带都歪歪斜斜的~ 没有办法放在paper里。
请问有经验的xdjm,怎么再不减少sample浓度的情况下，调整哪些条件让胶跑的整齐漂
亮点？
我们用的是全套invitrogen nupage system
sample 70度煮15分钟 (nupage LDS buffer instruction上的，说是比100度煮，条带
可以sharp点。instruction说10分钟，我还加了5分钟）
4%-12% bis-tris gel， 160 v 跑1个半小时的样子。
非常感谢~~~~~~~！！ |
r******m
发帖数: 5550 | 2 绝望的自己顶以下。。。
我能想到的，就是电压小点，慢慢的跑。。。不知道对不
mouse
【在 r******m 的大作中提到】
: 因为要detect的protein浓度比较小，所以每个sample都要上没有稀释过的5 ul mouse
: serum. 这让sample狠粘，跑出来的条带都歪歪斜斜的~ 没有办法放在paper里。
: 请问有经验的xdjm,怎么再不减少sample浓度的情况下，调整哪些条件让胶跑的整齐漂
: 亮点？
: 我们用的是全套invitrogen nupage system
: sample 70度煮15分钟 (nupage LDS buffer instruction上的，说是比100度煮，条带
: 可以sharp点。instruction说10分钟，我还加了5分钟）
: 4%-12% bis-tris gel， 160 v 跑1个半小时的样子。
: 非常感谢~~~~~~~！！
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l****e
发帖数: 32 | 3 才能跑5ul啊，我们的一个孔可以跑60ul... |
T**********t
发帖数: 1604 | |
r******a
发帖数: 285 | 5 跑一个小时看看
sample加样前先高速离心
mouse
【在 r******m 的大作中提到】
: 因为要detect的protein浓度比较小，所以每个sample都要上没有稀释过的5 ul mouse
: serum. 这让sample狠粘，跑出来的条带都歪歪斜斜的~ 没有办法放在paper里。
: 请问有经验的xdjm,怎么再不减少sample浓度的情况下，调整哪些条件让胶跑的整齐漂
: 亮点？
: 我们用的是全套invitrogen nupage system
: sample 70度煮15分钟 (nupage LDS buffer instruction上的，说是比100度煮，条带
: 可以sharp点。instruction说10分钟，我还加了5分钟）
: 4%-12% bis-tris gel， 160 v 跑1个半小时的样子。
: 非常感谢~~~~~~~！！
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f*********r
发帖数: 1233 | 6 与细胞/组织匀浆不同，血清中dna极低。粘稠主要因为蛋白和血脂。楼上说超高速离心
，是个不错的办法。能够去掉很多悬浊微粒。如果样品量有限，可以加过lysis buffer
以后再离心。
稀释总蛋白浓度。如果5ul/well这个量不能再降低，可以象楼上所说，用大胶、厚胶，
想办法增加volume/well。
如果有条件，可以用filter过滤掉不需要的蛋白。一般，条带扭曲多发生在小分子量。我估计你要的蛋白就不大。那么，你可以根据分子量，过滤掉大分子蛋白。millipore就有很多不同孔径的过滤系统可供选择。
条带形状不规整，很大程度上还因为蛋白denature得不够好。可以适当在loading buffer里增加sds浓度。
由于loading buffer与running buffer之间在表面活性上有差异，可以造成条带的扭曲
。为此，可以选用taurin buffer（代替glycin buffer）以弱化条带扭曲。甚至，有的
pi曾经建议，在上样之前，空跑至少10分钟。
用一般的样品跑胶，那么胶的品牌与型号之间的优劣不是很明显。你的sample比较特殊
，可能就放大了各厂家产品之间 |
r******m
发帖数: 5550 | 7 Thank you sooooo much~!!!!!
I need to print this out and keep it to my protocol record.
suggest banzhu to add it to jinghuaqu ah...
buffer
。我估计你要的蛋白就不大。那么，你可以根据分子量，过滤掉大分子蛋白。
millipore就有很多不同孔径的过滤系统可供选择。
buffer里增加sds浓度。
【在 f*********r 的大作中提到】
: 与细胞/组织匀浆不同，血清中dna极低。粘稠主要因为蛋白和血脂。楼上说超高速离心
: ，是个不错的办法。能够去掉很多悬浊微粒。如果样品量有限，可以加过lysis buffer
: 以后再离心。
: 稀释总蛋白浓度。如果5ul/well这个量不能再降低，可以象楼上所说，用大胶、厚胶，
: 想办法增加volume/well。
: 如果有条件，可以用filter过滤掉不需要的蛋白。一般，条带扭曲多发生在小分子量。我估计你要的蛋白就不大。那么，你可以根据分子量，过滤掉大分子蛋白。millipore就有很多不同孔径的过滤系统可供选择。
: 条带形状不规整，很大程度上还因为蛋白denature得不够好。可以适当在loading buffer里增加sds浓度。
: 由于loading buffer与running buffer之间在表面活性上有差异，可以造成条带的扭曲
: 。为此，可以选用taurin buffer（代替glycin buffer）以弱化条带扭曲。甚至，有的
: pi曾经建议，在上样之前，空跑至少10分钟。
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r******m
发帖数: 5550 | 8 you mean shorter time, higher voltage?
【在 r******a 的大作中提到】
: 跑一个小时看看
: sample加样前先高速离心
:
: mouse
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h****6
发帖数: 229 | 9 I remember there is antibody-bead method for pull down abundant albumin in
serum. |
I***a
发帖数: 13467 | |
