f*********e
发帖数: 1144 | 1 用Mass spec测出来差不多2倍差异，想用western验证，可是我不知道western能分辨出
两倍差异么？ |
p****n
发帖数: 9263 | 2 能
【在 f*********e 的大作中提到】
: 用Mass spec测出来差不多2倍差异，想用western验证，可是我不知道western能分辨出
: 两倍差异么？
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I***a
发帖数: 13467 | |
p******i
发帖数: 1092 | 4 顶楼上
不放心就多跑几次，再QUANTIFY一下
【在 f*********e 的大作中提到】
: 用Mass spec测出来差不多2倍差异，想用western验证，可是我不知道western能分辨出
: 两倍差异么？
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a*****n
发帖数: 2835 | 5 两杯的差异很容易看到的
不信你可以同样的样品上一倍和两杯的量试试
【在 f*********e 的大作中提到】
: 用Mass spec测出来差不多2倍差异，想用western验证，可是我不知道western能分辨出
: 两倍差异么？
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f*********e
发帖数: 1144 | 6 谢谢楼上的！！ 对western不熟，听这么一说，有信心多了。
【在 a*****n 的大作中提到】
: 两杯的差异很容易看到的
: 不信你可以同样的样品上一倍和两杯的量试试
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p**i
发帖数: 3525 | 7 用什么Mass spec测出来差不多2倍差异?
mass spect一般很难定量吧，除了特殊标记以外
【在 f*********e 的大作中提到】
: 用Mass spec测出来差不多2倍差异，想用western验证，可是我不知道western能分辨出
: 两倍差异么？
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K******S
发帖数: 10109 | 8 hehe, this is a very interesting issue. And lots of debating is going on on
both sides.
biology ppl always want to confirm mass spec result w/ western blot. Seems
like MS still have a long way to go to convince biology ppl that the MS
result is pretty confident.
【在 f*********e 的大作中提到】
: 用Mass spec测出来差不多2倍差异，想用western验证，可是我不知道western能分辨出
: 两倍差异么？
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f*********e
发帖数: 1144 | 9 不标记，关看peak area 和 spectral count都可以大概测出。虽然标记后会准一些，
但是也有很多不确定性。不标记，label free测，确实测不准差几倍，但是有无差异还
是可以看出来的。很多时候绝对差多少倍没什么意义，只要有差异就行了。
【在 p**i 的大作中提到】
: 用什么Mass spec测出来差不多2倍差异?
: mass spect一般很难定量吧，除了特殊标记以外
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f*********e
发帖数: 1144 | 10 赫赫，确实阿。我觉得western确实应该是最准的golden standard. 只是sensitivity
和 high throughput上面差很多。又太依赖抗体了。
一般来说ms和western的结果还是挺一致的，至少差异方向是一致的。
on
【在 K******S 的大作中提到】
: hehe, this is a very interesting issue. And lots of debating is going on on
: both sides.
: biology ppl always want to confirm mass spec result w/ western blot. Seems
: like MS still have a long way to go to convince biology ppl that the MS
: result is pretty confident.
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b*******g
发帖数: 1309 | 11 我感觉bio ppl 真正懂MS的不过，至少现在看来，很多人是会用仪器，
但是知其然不知其所以然
不知道究竟哪种MS仪器，哪种MS方法适合准确定量
对他们来说WB 便宜简单直观，而且熟悉，很有信心
on
【在 K******S 的大作中提到】
: hehe, this is a very interesting issue. And lots of debating is going on on
: both sides.
: biology ppl always want to confirm mass spec result w/ western blot. Seems
: like MS still have a long way to go to convince biology ppl that the MS
: result is pretty confident.
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h********n
发帖数: 4079 | 12 能不能问一下, 你的MS是什么方法(电离和检测方法). MS仪器定量准确的不太多. |
h********n
发帖数: 4079 | 13 即使学化学的, 很懂MS的也不太多.
我以前学有机, 觉得已经基本上懂MS了, 后来很多问题问了LD(学MS的), 才知道差距啊.
【在 b*******g 的大作中提到】
: 我感觉bio ppl 真正懂MS的不过，至少现在看来，很多人是会用仪器，
: 但是知其然不知其所以然
: 不知道究竟哪种MS仪器，哪种MS方法适合准确定量
: 对他们来说WB 便宜简单直观，而且熟悉，很有信心
:
: on
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b*******g
发帖数: 1309 | 14 lol
最搞笑的是学有机的，以为MS就是测个分子量。。。。
能做定量的MS及方法太多了，取决于你的样品，也许很简单也许很难
药厂招那么多学LCMS是有原因跟用处的
啊.
【在 h********n 的大作中提到】
: 即使学化学的, 很懂MS的也不太多.
: 我以前学有机, 觉得已经基本上懂MS了, 后来很多问题问了LD(学MS的), 才知道差距啊.
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O******e
发帖数: 4845 | 15 很多人是要看到WESTERN的带才放心的。MS都做出来了，WB不可能做不出来。
如果真做不出来了，MS的结果当然要打个问号。 |
s*****t
发帖数: 71 | 16 根据我们实验室100多个蛋白western验证MS结果的经验看，在抗体好用的情况下，2倍
MS差异western的成功率低于30%。楼主慎重。MS要比抗体灵敏太多！ |
f*********e
发帖数: 1144 | 17 ESI-Ion Trap
我前面贴也说了，目的不是测差几倍，而是看有无差异，2倍，3倍，5倍，无太大意义。
【在 h********n 的大作中提到】
: 能不能问一下, 你的MS是什么方法(电离和检测方法). MS仪器定量准确的不太多.
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f*********e
发帖数: 1144 | 18 赫赫，100多个蛋白，你老板真能放血阿！！ 买那么多抗体，$300 x 100 = $30,000 ?
现在funding不好，所以买哪个抗体就很小心。但我也听说ms其实缩小了差异，所以wb
可能也能验证出来。
【在 s*****t 的大作中提到】
: 根据我们实验室100多个蛋白western验证MS结果的经验看，在抗体好用的情况下，2倍
: MS差异western的成功率低于30%。楼主慎重。MS要比抗体灵敏太多！
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l****y
发帖数: 398 | 19 They could use tagged proteins.
but i agree MS is as good (or as bad) as WB.
?
wb
【在 f*********e 的大作中提到】
: 赫赫，100多个蛋白，你老板真能放血阿！！ 买那么多抗体，$300 x 100 = $30,000 ?
: 现在funding不好，所以买哪个抗体就很小心。但我也听说ms其实缩小了差异，所以wb
: 可能也能验证出来。
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m**********2
发帖数: 6568 | 20 en. habit of convention ba.
when we first started to do qRT-PCR, my boss always wanted to see northern.
Now we have more modern technology, and she wants to see qRT-PCR.
【在 O******e 的大作中提到】
: 很多人是要看到WESTERN的带才放心的。MS都做出来了，WB不可能做不出来。
: 如果真做不出来了，MS的结果当然要打个问号。
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b*******g
发帖数: 1309 | 21 unfortunately, Ion trap is NOT good for quantification, which is the disadvatage of Ion Trap.
If your protein concnetration is high, you need be more careful, since your result may mislead you.
义。
【在 f*********e 的大作中提到】
: ESI-Ion Trap
: 我前面贴也说了，目的不是测差几倍，而是看有无差异，2倍，3倍，5倍，无太大意义。
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f*********e
发帖数: 1144 | 22 是的，比如triple quad 肯定好滴多。但是出于综合考虑，对于initial screening，
ion trap还是最实用的。
我的样品浓度很低，我觉得就是低所以才可能不准，浓度高的话，random sampling到
的几率很高，重复性也好的多。
disadvatage of Ion Trap.
your result may mislead you.
【在 b*******g 的大作中提到】
: unfortunately, Ion trap is NOT good for quantification, which is the disadvatage of Ion Trap.
: If your protein concnetration is high, you need be more careful, since your result may mislead you.
:
: 义。
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b*******g
发帖数: 1309 | 23
【在 f*********e 的大作中提到】
: 是的，比如triple quad 肯定好滴多。但是出于综合考虑，对于initial screening，
: ion trap还是最实用的。
: 我的样品浓度很低，我觉得就是低所以才可能不准，浓度高的话，random sampling到
: 的几率很高，重复性也好的多。
:
: disadvatage of Ion Trap.
: your result may mislead you.
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K******S
发帖数: 10109 | 24 浓度有多低？
【在 f*********e 的大作中提到】
: 是的，比如triple quad 肯定好滴多。但是出于综合考虑，对于initial screening，
: ion trap还是最实用的。
: 我的样品浓度很低，我觉得就是低所以才可能不准，浓度高的话，random sampling到
: 的几率很高，重复性也好的多。
:
: disadvatage of Ion Trap.
: your result may mislead you.
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f*********e
发帖数: 1144 | 25 Starting: total 1mg whole cell lysate
After glycoprotein enrichment, no idea.
Assume: 100 glycoprotein obtained after pull-down and total amount is 1% of
total whole cell lysate, so each glycoprotein would be 100ng. Then split
into 3 aliquots and reconstitue in 30ul, so around 30ng for each protein at
the concentration of 1ng/ul. My estimation is actually lower, given the
target protein is low abuntant.
【在 K******S 的大作中提到】
: 浓度有多低？
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f*********e
发帖数: 1144 | 26 谢谢！很有道理。
我的样品dynamic range不会那么大。如果真的很大，样品浓度又高，就真要考虑作MRM
了。
【在 b*******g 的大作中提到】
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K******S
发帖数: 10109 | 27 如果有1ng/ul， 正好是很多NANO-LC-TRAP的舒服的浓度，
of
at
【在 f*********e 的大作中提到】
: Starting: total 1mg whole cell lysate
: After glycoprotein enrichment, no idea.
: Assume: 100 glycoprotein obtained after pull-down and total amount is 1% of
: total whole cell lysate, so each glycoprotein would be 100ng. Then split
: into 3 aliquots and reconstitue in 30ul, so around 30ng for each protein at
: the concentration of 1ng/ul. My estimation is actually lower, given the
: target protein is low abuntant.
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f*********e
发帖数: 1144 | 28 赫赫，正好也是nanoLC-Trap,托你吉言，希望歪打正着
我觉得浓度应该<1ng/ul,10倍之内
【在 K******S 的大作中提到】
: 如果有1ng/ul， 正好是很多NANO-LC-TRAP的舒服的浓度，
:
: of
: at
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s*****t
发帖数: 71 | 29 SRM或者MRM的话，trap还是不行，qqq才是王道。
同位素标记，相对定量的话，trap的应用才是最多的。
我前面说的就是同位素标记的相对定量的MS数据，2倍差异的，我们实验室的100多个WB
验证，大概有20-30%的情况下抗体不行，剩下70%抗体work的，能得到和MS相同结果的
也就30%不到。100多个抗体没有多少钱吧，比起来metabolically labeling 动物。 |
s*****t
发帖数: 71 | |
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b*******g
发帖数: 1309 | 31 我。。。。
【在 s*****t 的大作中提到】
: 借贴发问下，有哪个同学是要去asms的？
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