c**********n 发帖数: 99 | 1 最近一直在做TEM,周围也没什么人做,就自己对着protocol做。
有一些问题想请教有经验的朋友。
我用double staining (uranyl acetate + lead citrate)
一般UA 15min左右,LC 5min,但结果我的sample在低倍下(<1000)很难找到,
高倍的时候背景很重,分辨率不够高。
我2个月前配的UA LC之后,一直锡箔纸包着放4度冰箱。protocol上说可以这样保存好
几个月,但是我觉得最近staining的片子背景有密布的黑点点,应该是lead沉淀。在保
存的时候有什么需要注意的吗?
在配染色液的时候,都是在通风厨里称量吗?好像很不准。但是UA LC不是放射性就是
重金属,不在通风厨里称空气里会有很多粉尘。
在immuno-golden staining的时候,还需要最后double staining吗?我尝试过,但是
背景有时候也有很多黑点,请问如何让背景很干净?
感觉很多经验是protocol上反映不出来的,来这里请教一下做过的朋友。谢谢 |
s******y 发帖数: 28562 | 2 我没有用过铅,但是我用Uranium Acetate。
我不知道你做什么蛋白,一般来说Uranium acetate 本身就够了,似乎没有必要
再加铅啊。
另外,你在最终溶液里有没有加小分子来作为detergent? 我们一般都是使用前
加痕量的cytochrome C在最终溶液里,然后离心10分钟,取上清来用。
然后,你怎么加你的蛋白?怎么加染色溶液的?
这些操作都很重要的。
另外,浓度没所谓的。只要浓度差的不太多,染出来的效果就没有问题。我一般是先
称管子,然后把粉末放进去后再称管子重量。然后再按此计算要放多少溶液。就是为了
尽量减少和金属的接触。
【在 c**********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近一直在做TEM,周围也没什么人做,就自己对着protocol做。 : 有一些问题想请教有经验的朋友。 : 我用double staining (uranyl acetate + lead citrate) : 一般UA 15min左右,LC 5min,但结果我的sample在低倍下(<1000)很难找到, : 高倍的时候背景很重,分辨率不够高。 : 我2个月前配的UA LC之后,一直锡箔纸包着放4度冰箱。protocol上说可以这样保存好 : 几个月,但是我觉得最近staining的片子背景有密布的黑点点,应该是lead沉淀。在保 : 存的时候有什么需要注意的吗? : 在配染色液的时候,都是在通风厨里称量吗?好像很不准。但是UA LC不是放射性就是 : 重金属,不在通风厨里称空气里会有很多粉尘。
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s******y 发帖数: 28562 | 3 还有,作免疫金标记的时候,最多可以用银加强,
我印象中是不应该用uranium double stain的,否则背景会很厉害的。
【在 c**********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近一直在做TEM,周围也没什么人做,就自己对着protocol做。 : 有一些问题想请教有经验的朋友。 : 我用double staining (uranyl acetate + lead citrate) : 一般UA 15min左右,LC 5min,但结果我的sample在低倍下(<1000)很难找到, : 高倍的时候背景很重,分辨率不够高。 : 我2个月前配的UA LC之后,一直锡箔纸包着放4度冰箱。protocol上说可以这样保存好 : 几个月,但是我觉得最近staining的片子背景有密布的黑点点,应该是lead沉淀。在保 : 存的时候有什么需要注意的吗? : 在配染色液的时候,都是在通风厨里称量吗?好像很不准。但是UA LC不是放射性就是 : 重金属,不在通风厨里称空气里会有很多粉尘。
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w*******s 发帖数: 10 | 4 做过几个月的TEM,以前也出现类似的情况。个人感觉原因有以下几个:1 树脂切片不好
(金刚石刀上有小缺口,会导致切片上有破损),UA之后,虽然清洗了,当时可能会有
微量residual UA在不光滑的树脂处,接下来LC时,LC会和UA反应,导致背景;2 在LC
时,吸LC溶液速度太快,导致有空气被trap在铜网周围,LC和空气中co2反应导致背景
;3 LC溶液本身有问题,做stock solution的时候用filter过滤,然后分开保存(一个
管里面不要太多,因为以后使用的时候会导致LC暴露在空气中,LC和co2产生背景),
同时可以考虑使用前离心一下。这是我能想到的几个原因,当我很小心的做这几个步骤
之后,基本上没有什么背景了。
对90-120nm的切片,我一般UA 5min@4C;rinse by 50ml mmh2o@4C;vacuum dry 5-
10min;LC 2min@4C;rinse by 50mlmmh2o;vacuum dry 5min。image contrast很好。
好运。 |