c**********n
发帖数: 99 | 1 最近一直在做TEM，周围也没什么人做，就自己对着protocol做。
有一些问题想请教有经验的朋友。
我用double staining (uranyl acetate + lead citrate)
一般UA 15min左右，LC 5min，但结果我的sample在低倍下（<1000）很难找到，
高倍的时候背景很重，分辨率不够高。
我2个月前配的UA LC之后，一直锡箔纸包着放4度冰箱。protocol上说可以这样保存好
几个月，但是我觉得最近staining的片子背景有密布的黑点点，应该是lead沉淀。在保
存的时候有什么需要注意的吗?
在配染色液的时候，都是在通风厨里称量吗？好像很不准。但是UA LC不是放射性就是
重金属，不在通风厨里称空气里会有很多粉尘。
在immuno-golden staining的时候，还需要最后double staining吗？我尝试过，但是
背景有时候也有很多黑点，请问如何让背景很干净？
感觉很多经验是protocol上反映不出来的，来这里请教一下做过的朋友。谢谢 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 我没有用过铅，但是我用Uranium Acetate。
我不知道你做什么蛋白，一般来说Uranium acetate 本身就够了，似乎没有必要
再加铅啊。
另外，你在最终溶液里有没有加小分子来作为detergent? 我们一般都是使用前
加痕量的cytochrome C在最终溶液里，然后离心10分钟，取上清来用。
然后，你怎么加你的蛋白？怎么加染色溶液的？
这些操作都很重要的。
另外，浓度没所谓的。只要浓度差的不太多，染出来的效果就没有问题。我一般是先
称管子，然后把粉末放进去后再称管子重量。然后再按此计算要放多少溶液。就是为了
尽量减少和金属的接触。
【在 c**********n 的大作中提到】
: 最近一直在做TEM，周围也没什么人做，就自己对着protocol做。
: 有一些问题想请教有经验的朋友。
: 我用double staining (uranyl acetate + lead citrate)
: 一般UA 15min左右，LC 5min，但结果我的sample在低倍下（<1000）很难找到，
: 高倍的时候背景很重，分辨率不够高。
: 我2个月前配的UA LC之后，一直锡箔纸包着放4度冰箱。protocol上说可以这样保存好
: 几个月，但是我觉得最近staining的片子背景有密布的黑点点，应该是lead沉淀。在保
: 存的时候有什么需要注意的吗?
: 在配染色液的时候，都是在通风厨里称量吗？好像很不准。但是UA LC不是放射性就是
: 重金属，不在通风厨里称空气里会有很多粉尘。
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s******y
发帖数: 28562 | 3 还有，作免疫金标记的时候，最多可以用银加强，
我印象中是不应该用uranium double stain的，否则背景会很厉害的。
【在 c**********n 的大作中提到】
: 最近一直在做TEM，周围也没什么人做，就自己对着protocol做。
: 有一些问题想请教有经验的朋友。
: 我用double staining (uranyl acetate + lead citrate)
: 一般UA 15min左右，LC 5min，但结果我的sample在低倍下（<1000）很难找到，
: 高倍的时候背景很重，分辨率不够高。
: 我2个月前配的UA LC之后，一直锡箔纸包着放4度冰箱。protocol上说可以这样保存好
: 几个月，但是我觉得最近staining的片子背景有密布的黑点点，应该是lead沉淀。在保
: 存的时候有什么需要注意的吗?
: 在配染色液的时候，都是在通风厨里称量吗？好像很不准。但是UA LC不是放射性就是
: 重金属，不在通风厨里称空气里会有很多粉尘。
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w*******s
发帖数: 10 | 4 做过几个月的TEM,以前也出现类似的情况。个人感觉原因有以下几个：1 树脂切片不好
（金刚石刀上有小缺口，会导致切片上有破损），UA之后，虽然清洗了，当时可能会有
微量residual UA在不光滑的树脂处，接下来LC时，LC会和UA反应，导致背景；2 在LC
时，吸LC溶液速度太快，导致有空气被trap在铜网周围，LC和空气中co2反应导致背景
；3 LC溶液本身有问题，做stock solution的时候用filter过滤，然后分开保存（一个
管里面不要太多，因为以后使用的时候会导致LC暴露在空气中，LC和co2产生背景），
同时可以考虑使用前离心一下。这是我能想到的几个原因，当我很小心的做这几个步骤
之后，基本上没有什么背景了。
对90－120nm的切片，我一般UA 5min@4C；rinse by 50ml mmh2o@4C；vacuum dry 5－
10min；LC 2min@4C；rinse by 50mlmmh2o；vacuum dry 5min。image contrast很好。
好运。 |
