l*******e
发帖数: 214 | 1 不知道版上有没有做NMR的朋友。
最近在测蛋白的RDC，用的是900MHz的Bruker。具体情况是这样：
同一个蛋白分子，用了两种不同的标记方法 （一个是uniformly 15N labeled, 一个是
selective 15N-lys labeled）,之后都在同一个位置加了一个paramagnetic chelating
tag,这样蛋白分子就intrinsically aligned.
结果，在对比两个样品中lys residues 的RDC时， 相同的lys residue得到的RDC值却
很不一样。有的居然相差有15Hz。请问这会是什么原因？
第二个问题：研究对象是selectively 15N-lys labeled protein. 同样也加了
paramagnetic chelating tag. 在600MHz和900MHz下得到的RDC值也不完全出现 RDC正
比于磁场强度的平方的关系，六组数据，有两组相差很大。图谱很容易分辨，不会有
assign出错的可能。请高人指点。 | s********m
发帖数: 171 | | p****s
发帖数: 3153 | 3 問個小白問題，做RDC的時候都需要在重水里表達然後氫交換的樣品是吧？或者這樣效
果會更好？
chelating
【在 l*******e 的大作中提到】
: 不知道版上有没有做NMR的朋友。
: 最近在测蛋白的RDC，用的是900MHz的Bruker。具体情况是这样：
: 同一个蛋白分子，用了两种不同的标记方法 （一个是uniformly 15N labeled, 一个是
: selective 15N-lys labeled）,之后都在同一个位置加了一个paramagnetic chelating
: tag,这样蛋白分子就intrinsically aligned.
: 结果，在对比两个样品中lys residues 的RDC时， 相同的lys residue得到的RDC值却
: 很不一样。有的居然相差有15Hz。请问这会是什么原因？
: 第二个问题：研究对象是selectively 15N-lys labeled protein. 同样也加了
: paramagnetic chelating tag. 在600MHz和900MHz下得到的RDC值也不完全出现 RDC正
: 比于磁场强度的平方的关系，六组数据，有两组相差很大。图谱很容易分辨，不会有
| l*******e
发帖数: 214 | 4 效果是好但不一定需要，我想只是重水就不会看见裂缝峰
【在 p****s 的大作中提到】
: 問個小白問題，做RDC的時候都需要在重水里表達然後氫交換的樣品是吧？或者這樣效
: 果會更好？
:
: chelating
| l*******e
发帖数: 214 | 5 我有两个样品,因为标记的关系分子量只差500不到：
1.Uniformly 15N,13C labeled Ubiquitin T66C in 50 mM phosphate buffer, pH6.5,
加了一个paramagnetic DOTA-M8 tag 到C66上, 用900 MHz NMR (ipap)得到了一组 HN
RDC值.我目前只看其中三个residue的值: K33,K27,K29.
2.15N-lys labeled Ubiquitin T66C (7 Lys residues) in 50 mM phosphate buffer,
pH6.5, 也加了一个paramagnetic DOTA-M8 tag 到C66上,用900MHz (ipap) 和 600MHz
(coupled HSQC) NMR分别得到了一组RDC值.也只看其中三个residue的值: K33,K27,
K29. 结果这两组不同场强下的RDC值找不到正比于磁场强度的平方关系, 尤其residue
K27 差得相当大.
当我对比样品一和样品二时，同在900MHz下的RDC值也不相同，也是K2
【在 s********m 的大作中提到】
: 具体说说你的样品，我也许能帮你，老本行了
| p****s
发帖数: 3153 | 6 液相我基本不懂啊...也就知道基本原理而已
你的pulse sequence有没有decouple 13C?
5,
HN
buffer,
600MHz
residue
【在 l*******e 的大作中提到】
: 我有两个样品,因为标记的关系分子量只差500不到：
: 1.Uniformly 15N,13C labeled Ubiquitin T66C in 50 mM phosphate buffer, pH6.5,
: 加了一个paramagnetic DOTA-M8 tag 到C66上, 用900 MHz NMR (ipap)得到了一组 HN
: RDC值.我目前只看其中三个residue的值: K33,K27,K29.
: 2.15N-lys labeled Ubiquitin T66C (7 Lys residues) in 50 mM phosphate buffer,
: pH6.5, 也加了一个paramagnetic DOTA-M8 tag 到C66上,用900MHz (ipap) 和 600MHz
: (coupled HSQC) NMR分别得到了一组RDC值.也只看其中三个residue的值: K33,K27,
: K29. 结果这两组不同场强下的RDC值找不到正比于磁场强度的平方关系, 尤其residue
: K27 差得相当大.
: 当我对比样品一和样品二时，同在900MHz下的RDC值也不相同，也是K2
| s********m
发帖数: 171 | 7 关于single point attachment, 总是存在一个flexibility的问题。有关DOTA－M8的文
章，并没有从理论上解释为什么把tag真正固定住了。但是从文章看，的确得到了很大
的PCS和RDC。
但是问题更有可能在cys的attachement， pH6。5，是否95％以上的蛋白都attach上tag
了？这个attachment是否非常稳定？我建议可以将样品做个MS（最好两次）。因为同一
个样品如果600和900的测量值如果和理论预测不一样，并且你确定谱的process没问题
的话。只有可能是样品随着时间发生了变化。虽然理论我不是很精通，但是我感觉
paramagnetic induced RDC的测量关键看样品。
5,
HN
buffer,
600MHz
residue
【在 l*******e 的大作中提到】
: 我有两个样品,因为标记的关系分子量只差500不到：
: 1.Uniformly 15N,13C labeled Ubiquitin T66C in 50 mM phosphate buffer, pH6.5,
: 加了一个paramagnetic DOTA-M8 tag 到C66上, 用900 MHz NMR (ipap)得到了一组 HN
: RDC值.我目前只看其中三个residue的值: K33,K27,K29.
: 2.15N-lys labeled Ubiquitin T66C (7 Lys residues) in 50 mM phosphate buffer,
: pH6.5, 也加了一个paramagnetic DOTA-M8 tag 到C66上,用900MHz (ipap) 和 600MHz
: (coupled HSQC) NMR分别得到了一组RDC值.也只看其中三个residue的值: K33,K27,
: K29. 结果这两组不同场强下的RDC值找不到正比于磁场强度的平方关系, 尤其residue
: K27 差得相当大.
: 当我对比样品一和样品二时，同在900MHz下的RDC值也不相同，也是K2
| p****s
发帖数: 3153 | 8 稍微浏览了一下那文，PCS还真大啊....
话说有没有可能是不同磁场强度下的PCS导致的？我是小白，嗯
tag
【在 s********m 的大作中提到】
: 关于single point attachment, 总是存在一个flexibility的问题。有关DOTA－M8的文
: 章，并没有从理论上解释为什么把tag真正固定住了。但是从文章看，的确得到了很大
: 的PCS和RDC。
: 但是问题更有可能在cys的attachement， pH6。5，是否95％以上的蛋白都attach上tag
: 了？这个attachment是否非常稳定？我建议可以将样品做个MS（最好两次）。因为同一
: 个样品如果600和900的测量值如果和理论预测不一样，并且你确定谱的process没问题
: 的话。只有可能是样品随着时间发生了变化。虽然理论我不是很精通，但是我感觉
: paramagnetic induced RDC的测量关键看样品。
:
: 5,
| l*******e
发帖数: 214 | 9 有的，裂分峰是因为其它H引起的，比如H alpha跟amide N之间。
【在 p****s 的大作中提到】
: 液相我基本不懂啊...也就知道基本原理而已
: 你的pulse sequence有没有decouple 13C?
:
: 5,
: HN
: buffer,
: 600MHz
: residue
| l*******e
发帖数: 214 | 10 我们就是他们合成的tag。文章中说tag peptide bond可能有cis-trans两种构象,的确
他们没办法固定这个tag.他们自己的两个蛋白，加上我这个蛋白都出现了两种构象。不
过这个tag的反应非常迅速（pH5），而且很彻底。对低浓度的蛋白很有效。pH6.5是最
后tag上去之后才换的buffer。
两次测量的时间的确相隔有点久，我是应该在每次做nmr前ms一下。谢谢你的解答。
tag
【在 s********m 的大作中提到】
: 关于single point attachment, 总是存在一个flexibility的问题。有关DOTA－M8的文
: 章，并没有从理论上解释为什么把tag真正固定住了。但是从文章看，的确得到了很大
: 的PCS和RDC。
: 但是问题更有可能在cys的attachement， pH6。5，是否95％以上的蛋白都attach上tag
: 了？这个attachment是否非常稳定？我建议可以将样品做个MS（最好两次）。因为同一
: 个样品如果600和900的测量值如果和理论预测不一样，并且你确定谱的process没问题
: 的话。只有可能是样品随着时间发生了变化。虽然理论我不是很精通，但是我感觉
: paramagnetic induced RDC的测量关键看样品。
:
: 5,
| l*******e
发帖数: 214 | 11 实验得到的PCS的值在N和H两个方向并没有随着场强变化，理论上它是核与paramagnetic
center之间的dipole-dipole interaction, 应该只跟它们之间距离和角度有关。RDC倒
是会受场强影响，但PCS在不同场强下不发生变化，就无法去说它跟RDC之间可能有什么
关联了。
仔细想想，我的第一个uniformly labeled 样品在经过高温低温循环的时候就变化了一
些，文献里提到的倒是说样品经过温变是可恢复的。而我有两个巨大的pcs突然消失了
，有一个改变了。不知道哪个地方又变了。可能还得回到样品。
谢谢你的热心帮忙，你们的想法对我想问题很有帮助。
【在 p****s 的大作中提到】
: 稍微浏览了一下那文，PCS还真大啊....
: 话说有没有可能是不同磁场强度下的PCS导致的？我是小白，嗯
:
: tag
| s********m
发帖数: 171 | 12 PCS和RDC是有关联的，这两者共享一个tensor，只要知道其中的一个tensor值，RDC可
以推出来。如果PCS都变了，肯定是样品发生了变化。而且如果你的tag存在Isomers的
话，就更复杂了，你看到的是一个平均了的现象。当时我看那篇JACS时，就感到有点奇
怪。 | s********m
发帖数: 171 | |
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