F******y
发帖数: 1988 | 1 一般情况下蛋白电泳都用Tris-Glycine buffer system
低分子量蛋白（10kD一下）一般推荐用Tris-Tricine buffer system
有没有用过这种方法的筒子们上来说一下，能有详细的protocol，kit catalogue等的
最好，没有的话讲讲实验tips也好。
包子奉上，小生在此有礼了。 |
c******y
发帖数: 148 | 2 个人的配方。
13% tris tricine分离胶 stock 4摄氏度不超过4周
40%丙烯酰胺 156ml
3Mtris HCl pH 8.45 160ml
10% SDS 15ml
H2O 113ml
甘油 36ml
每100ml加10%APS 500ul， TEMED 20ul
stacking gel， 现配
40%丙烯酰胺 1ml
3Mtris HCl pH 8.45 3.33ml
10% SDS 0.31ml
H2O 5.35ml
每10ml加10%APS 100ul， TEMED 10ul
15*Anode buffer
3M tris Hcl pH 8.9
5*Kathode buffer pH 8.25 用时稀释1*，加0.1% SDS
0.5M Tris
0.5M Tricine
分离胶可以考虑16%，也可以做成10-16%梯度胶，不过分子量小的话，不梯度也行 |
F******y
发帖数: 1988 | 3 非常有用阿，太感谢了
双黄大包子
【在 c******y 的大作中提到】
: 个人的配方。
: 13% tris tricine分离胶 stock 4摄氏度不超过4周
: 40%丙烯酰胺 156ml
: 3Mtris HCl pH 8.45 160ml
: 10% SDS 15ml
: H2O 113ml
: 甘油 36ml
: 每100ml加10%APS 500ul， TEMED 20ul
: stacking gel， 现配
: 40%丙烯酰胺 1ml
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p****s
发帖数: 3153 | 4 check this
http://www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/full/nprot.2006.4.html
【在 F******y 的大作中提到】
: 一般情况下蛋白电泳都用Tris-Glycine buffer system
: 低分子量蛋白（10kD一下）一般推荐用Tris-Tricine buffer system
: 有没有用过这种方法的筒子们上来说一下，能有详细的protocol，kit catalogue等的
: 最好，没有的话讲讲实验tips也好。
: 包子奉上，小生在此有礼了。
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F******y
发帖数: 1988 | 5 还想请教如下的问题
1。制胶的时间大概多久（指从把胶注入胶板到能够使用的时间）
2，请问您用的marker protein是什么（能告诉我catalogue number最好了）
3，Running 和Transferring的条件分别是什么（电流/Gel，电压/Gel,多长时间？)
4，转膜时用的那种膜（PVDF？）
【在 c******y 的大作中提到】
: 个人的配方。
: 13% tris tricine分离胶 stock 4摄氏度不超过4周
: 40%丙烯酰胺 156ml
: 3Mtris HCl pH 8.45 160ml
: 10% SDS 15ml
: H2O 113ml
: 甘油 36ml
: 每100ml加10%APS 500ul， TEMED 20ul
: stacking gel， 现配
: 40%丙烯酰胺 1ml
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F******y
发帖数: 1988 | |
F******y
发帖数: 1988 | 7 sinister同学说什么了阿，为什么删贴阿
欢迎更多有经验的同学进来讨论，都有包子。 |
f********n
发帖数: 6465 | 8 为什么姐姐博士期间没有做过western blot啊? |
T**********t
发帖数: 1604 | 9 我一般是用5%的浓缩胶和15%的分离胶，不加甘油，别的基本一样。倒是从来没有试过
分离胶配储液放好几个星期的，都是现配现用。
【在 c******y 的大作中提到】
: 个人的配方。
: 13% tris tricine分离胶 stock 4摄氏度不超过4周
: 40%丙烯酰胺 156ml
: 3Mtris HCl pH 8.45 160ml
: 10% SDS 15ml
: H2O 113ml
: 甘油 36ml
: 每100ml加10%APS 500ul， TEMED 20ul
: stacking gel， 现配
: 40%丙烯酰胺 1ml
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T**********t
发帖数: 1604 | 10 你如果自己没有制胶的经验，不如买预制胶好了，效果比自己配的好太多了，还省事。
我自己制胶一般花40分钟左右，分离胶和浓缩胶一般10分钟就凝了，15分钟左右基本上
肯定凝得很好了，再加上前后准备的时间。
invitrogen的protein marker从3.5K到260K，应该很够用。cat #是LC5800或者LC5801
。其实protein marker都差不多，promega和fisher的我也用得挺好，就是没有那么小
的分子量，但做多了就知道自己的目标蛋白该跑在什么相对位置，毛估估也对付得过去。
一般我跑bio-rad的mini胶，用5%浓缩15%分离的话，常温跑160V恒压40分钟左右。如果
是预制胶，按照预制胶的说明书来就好了。
我不怎么做western blot，所以transfer的条件就不知道了。
【在 F******y 的大作中提到】
: 还想请教如下的问题
: 1。制胶的时间大概多久（指从把胶注入胶板到能够使用的时间）
: 2，请问您用的marker protein是什么（能告诉我catalogue number最好了）
: 3，Running 和Transferring的条件分别是什么（电流/Gel，电压/Gel,多长时间？)
: 4，转膜时用的那种膜（PVDF？）
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F******y
发帖数: 1988 | 11 做过了
一般用的是Tris-glycine buffer system
【在 f********n 的大作中提到】
: 为什么姐姐博士期间没有做过western blot啊?
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F******y
发帖数: 1988 | 12 非常有用的tips
受教了
LC5801
去。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 你如果自己没有制胶的经验，不如买预制胶好了，效果比自己配的好太多了，还省事。
: 我自己制胶一般花40分钟左右，分离胶和浓缩胶一般10分钟就凝了，15分钟左右基本上
: 肯定凝得很好了，再加上前后准备的时间。
: invitrogen的protein marker从3.5K到260K，应该很够用。cat #是LC5800或者LC5801
: 。其实protein marker都差不多，promega和fisher的我也用得挺好，就是没有那么小
: 的分子量，但做多了就知道自己的目标蛋白该跑在什么相对位置，毛估估也对付得过去。
: 一般我跑bio-rad的mini胶，用5%浓缩15%分离的话，常温跑160V恒压40分钟左右。如果
: 是预制胶，按照预制胶的说明书来就好了。
: 我不怎么做western blot，所以transfer的条件就不知道了。
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f********n
发帖数: 6465 | 13 差别很大吗?
【在 F******y 的大作中提到】
: 做过了
: 一般用的是Tris-glycine buffer system
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F******y
发帖数: 1988 | 14 你看前面的帖子阿
【在 f********n 的大作中提到】
: 差别很大吗?
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c******y
发帖数: 148 | 15
1, 1-2hrs
2, fermentas prestained PAGE ruler google
3, Running, big gel constant 70V overnight, transferring as Tris glycine gel
4, PVDF or NC
【在 F******y 的大作中提到】
: 还想请教如下的问题
: 1。制胶的时间大概多久（指从把胶注入胶板到能够使用的时间）
: 2，请问您用的marker protein是什么（能告诉我catalogue number最好了）
: 3，Running 和Transferring的条件分别是什么（电流/Gel，电压/Gel,多长时间？)
: 4，转膜时用的那种膜（PVDF？）
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c******y
发帖数: 148 | 16
呵呵 懒了 一次就用掉200ml，消耗很快，倒是stacking gel从来不敢这样，很快就坏
掉了
不过，现在更懒了，二维不用stacking gel，直接跑
【在 T**********t 的大作中提到】
: 我一般是用5%的浓缩胶和15%的分离胶，不加甘油，别的基本一样。倒是从来没有试过
: 分离胶配储液放好几个星期的，都是现配现用。
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b****n
发帖数: 8 | 17 我用过invitrogen 16% Tricine gel, 分离一个11kD的蛋白，效果比invitrogen 10%
bis-Tris gel 好太多了。
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/EC66955BOX
但是我也买了它的running buffer 和2X sample buffer， 不过这两种自己配起来也不
难的。
【在 F******y 的大作中提到】
: 一般情况下蛋白电泳都用Tris-Glycine buffer system
: 低分子量蛋白（10kD一下）一般推荐用Tris-Tricine buffer system
: 有没有用过这种方法的筒子们上来说一下，能有详细的protocol，kit catalogue等的
: 最好，没有的话讲讲实验tips也好。
: 包子奉上，小生在此有礼了。
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T**********t
发帖数: 1604 | 18 10%的胶跑11kD的蛋白不太合适吧。用Bis-Tris或者Tris-Glycine的梯度胶应该也能分
得很好的。
【在 b****n 的大作中提到】
: 我用过invitrogen 16% Tricine gel, 分离一个11kD的蛋白，效果比invitrogen 10%
: bis-Tris gel 好太多了。
: http://products.invitrogen.com/ivgn/product/EC66955BOX
: 但是我也买了它的running buffer 和2X sample buffer， 不过这两种自己配起来也不
: 难的。
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F******y
发帖数: 1988 | 19 你都是直接买现成的胶阿，实验室有钱就是好
本人是第一次用tris-tricine buffer system
这次就定了一个Acrylamide-Bis Solution和一个低分子量的protein marker
其他的都准备自己配了，不知道结果会怎样，期待中。。。
【在 b****n 的大作中提到】
: 我用过invitrogen 16% Tricine gel, 分离一个11kD的蛋白，效果比invitrogen 10%
: bis-Tris gel 好太多了。
: http://products.invitrogen.com/ivgn/product/EC66955BOX
: 但是我也买了它的running buffer 和2X sample buffer， 不过这两种自己配起来也不
: 难的。
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F******y
发帖数: 1988 | 20 刚试了一次Tris-Tricine SDS-PAGE先跑了一下protein marker
效果不好，想直接贴图上来，继续向大家征求建议。 |
