H***e
发帖数: 223 | 1 我想到的方法是：
1）PCR基因的3'和5’端的两个片段；
2）PCR一个抗性标记；
3）把抗性标记连接在两个片段中间；
4）把整个片段连在一个质粒上，转到细菌中；
5）涂带抗生素的平板筛选基因缺失的细菌。
请问这样做可以吗，如果缺失的是一个house keeping gene还能这么做吗。
盼有经验的同学能站内信教我一下，谢谢。 |
Z******5
发帖数: 435 | 2 1，貌似对质粒有特别要求，要那种在多数细菌中都不能复制的自杀质粒吧（和一种蛋
白质有关）。
2，缺失管家基因是不是可以考虑在条件培养基上培养？（没做过，瞎诌的）
【在 H***e 的大作中提到】
: 我想到的方法是：
: 1）PCR基因的3'和5’端的两个片段；
: 2）PCR一个抗性标记；
: 3）把抗性标记连接在两个片段中间；
: 4）把整个片段连在一个质粒上，转到细菌中；
: 5）涂带抗生素的平板筛选基因缺失的细菌。
: 请问这样做可以吗，如果缺失的是一个house keeping gene还能这么做吗。
: 盼有经验的同学能站内信教我一下，谢谢。
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h**********r
发帖数: 671 | 3 难易程度因细菌而异，有的菌你敲两三个基因就发PNAS,有的你挨个儿敲1000个基因也
许可以发PNAS。
敲除可以用mob型的自杀质粒或者类似于Tn5转座的质粒。DNA导入可以电转也可以二亲
（三亲）结合转导。具体情况具体分析。
还有的可以double crossover把marker切掉，利于下一轮的敲除。
你可以看下这篇paper,Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived
from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined
deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum.
Gene, 145 (1994) 69-73.
质粒pK18mobsacB在G+,G-细菌用的都很广泛，全序列已知。可以从ATCC买到。
house keeping gene不知道，看是不是条件致死啥的或者营养缺陷型。又不知道你说的
是啥细菌。 |
k*****o
发帖数: 1486 | 4 你讲的是经典microbial genetics，当然可以，大家都这么做过的。
housekeeping gene当然不能直接作，除非像二楼说的你清楚这gene是干什么的，然后
从培养基里补，比如说合成Lysine这种得essential gene，敲了就不能用minimal
medium了。
但是可以先转一个其他的去替换，方法实在多的数不过来，还是看你自己情况而定吧（
PS直接问你老板比在版上找块多了） |
H***e
发帖数: 223 | 5 我做的是Mycobacterium。想缺失的是TCA cycle里的一个酶的编码基因。
老板不跟我讨论实验，只要结果。 |
H***e
发帖数: 223 | 6 我做的是Mycobacterium。想缺失的是TCA cycle里的一个酶的编码基因。
老板不跟我讨论实验，只要结果。 |
k*****o
发帖数: 1486 | 7 Mycobacterium的substrain太多了,先看看你说的TCA cycle里的enzyme有几套.确定有
两套以上的话可以踢掉一个.
只有一套就只能替换.很多情况下培养基里面加大量TCA里面的compound都没用.读一下
别人paper看看别人怎么做的吧 |
h**********r
发帖数: 671 | 8 I don't know anything about this strain. Is it a high GC content actinomyces
? The plasmid perhaps work for the strain.
For the genes involved in TCA cycle, it really depends on the enzymes.
Sometimes there are alternative pathways and metabolic flexibility. There
might also be other isoenzymes. You may add some substance to the media or
clone the similar genes with the same function from other bacteria to
restore the phenotype. |
