K**********e 发帖数: 188 | 1 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗,在他手里,一抗1:500 二抗1: 10000
很干净,几乎没有非特异的带。在
我手里,同样的稀释比例,检测同样的细胞抽提物,无数条带,而且连marker都出来了
。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
是有很多非特异的带,主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗?
怀疑自己手笨。别人用的好好的,到我手里怎么就不work。
incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
奶
他那个抗体是ChIP级的 人家都用来做ChIP了 效果很好。在我手里这个德性 哭死 |
b**2 发帖数: 1140 | 2 Blocking? BSA? Milk?
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【在 K**********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗,在他手里,一抗1:500 二抗1: 10000 : 很干净,几乎没有非特异的带。在 : 我手里,同样的稀释比例,检测同样的细胞抽提物,无数条带,而且连marker都出来了 : 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还 : 是有很多非特异的带,主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。 : 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗? : 怀疑自己手笨。别人用的好好的,到我手里怎么就不work。 : incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟 : 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛 : 奶
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s******y 发帖数: 28562 | 3 你应该在同一个胶上放进一个positive control, one negative control.
然后再试一次。别人用的情况不能直接搬到你那里。
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【在 K**********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗,在他手里,一抗1:500 二抗1: 10000 : 很干净,几乎没有非特异的带。在 : 我手里,同样的稀释比例,检测同样的细胞抽提物,无数条带,而且连marker都出来了 : 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还 : 是有很多非特异的带,主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。 : 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗? : 怀疑自己手笨。别人用的好好的,到我手里怎么就不work。 : incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟 : 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛 : 奶
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o**4 发帖数: 35028 | 4 block时间长一点,1小时吧,
然后就是二抗之后使劲洗,背景会好很多,我都是至少3次1小时的洗的
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【在 K**********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗,在他手里,一抗1:500 二抗1: 10000 : 很干净,几乎没有非特异的带。在 : 我手里,同样的稀释比例,检测同样的细胞抽提物,无数条带,而且连marker都出来了 : 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还 : 是有很多非特异的带,主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。 : 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗? : 怀疑自己手笨。别人用的好好的,到我手里怎么就不work。 : incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟 : 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛 : 奶
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W****C 发帖数: 1937 | 5 你蛋白上样没加多了吧?你的抗体没变性吧? 用前高速离心一下
你可以自己trouble shooting 啊 比如不加1抗 只加2抗看是不是很多带 |
o**4 发帖数: 35028 | 6 最好在4度冷室做western,室温抗体失活比较快(如果反复使用抗体的话)
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【在 K**********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗,在他手里,一抗1:500 二抗1: 10000 : 很干净,几乎没有非特异的带。在 : 我手里,同样的稀释比例,检测同样的细胞抽提物,无数条带,而且连marker都出来了 : 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还 : 是有很多非特异的带,主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。 : 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗? : 怀疑自己手笨。别人用的好好的,到我手里怎么就不work。 : incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟 : 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛 : 奶
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n***w 发帖数: 2405 | 7 让我想起来那个印度阿三sabotage的故事。。。 |
p******i 发帖数: 1092 | 8 有没有可能你 转膜 的某些细节和别人不同?
【在 K**********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗,在他手里,一抗1:500 二抗1: 10000 : 很干净,几乎没有非特异的带。在 : 我手里,同样的稀释比例,检测同样的细胞抽提物,无数条带,而且连marker都出来了 : 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还 : 是有很多非特异的带,主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。 : 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗? : 怀疑自己手笨。别人用的好好的,到我手里怎么就不work。 : incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟 : 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛 : 奶
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s*****g 发帖数: 7857 | 9 洗的时间和TBST溶液的体积都有关。
多用TBST溶液,每次洗10分钟
显影时间长,背景就多。
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v***a 发帖数: 1242 | 10 如果你们的抗体是同一lot的,并且是作为一抗重复使用的(假设其它条件都完全一致
),那你把你的用多了几次以后看看是否杂band会少点。
我曾遇到过有的抗体越用越干净的情况。刚用的几次会很脏。
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c******r 发帖数: 3778 | 11 不知道你是新手还是老手?
大侠咱们不熟哈,这个问题要是冒犯请原谅哈。
我问这个的原因是如果是新手,那原因可能是很简单的,比如二抗之后是用PBS还是
milk洗的?二抗多用1:10000,不用自己调整。一般都调整一抗就可以了。。。可能是
些非常简单的原因哈
如果是千佬,跑的胶比别人吃的糕还多,那多半不是技术原因。。。比如,你的抗体值
钱不?能不能自己单独弄一份,或者偷偷跟别的实验室借一点?这个别人其他实验结果
怎么样?给出的结果是原片还是powerpoint?
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【在 K**********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗,在他手里,一抗1:500 二抗1: 10000 : 很干净,几乎没有非特异的带。在 : 我手里,同样的稀释比例,检测同样的细胞抽提物,无数条带,而且连marker都出来了 : 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还 : 是有很多非特异的带,主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。 : 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗? : 怀疑自己手笨。别人用的好好的,到我手里怎么就不work。 : incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟 : 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛 : 奶
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C******r 发帖数: 790 | 12 我也是约来越不会做western了
在以前实验室,从没做过的三四个内源蛋白CoIP,一次就能做出来
现在实验室,这次有的信号(doublet磷酸化band)下次就没有了(只有脏背景,没有
条带),搞得我每次去显影都提心吊胆
即使cell line相同,抗体相同,稀释倍数相同,一个人western跟另一个人western不
一样的可能原因太多了,试着列举一下:
1、cell lysis buffer的离子强度和去污剂强度不同,裂解时间长短不同,导致你们
lysate里的蛋白种量有差异;至于要看磷酸化band的话,裂解液是否加phosphotate
inhibitor, 加的种类,也超级影响结果。我不加phosphotase inhibitor的话,有时候
可以看到band shift,但更多时候看不到。
2、SDS胶的浓度,Tris的浓度和pH;这个有人说有影响,我还没有比较过。
3、转膜的电流、时间、温度,以及转膜液里的离子强度(Tris和Glycine的量),以及
是否加有SDS,都会影响转膜效果。个别抗体对转膜有没有SDS会很敏感,没有哪个配方
是绝对的好。
4、一抗和二抗的稀释倍率、时间长短、和温度条件。在你的case里,温度时间和稀释
都跟另外那个人相同,应该不是这一步的原因。eg.有些弱的信号,RT短时看不到,RT
长时就被背景盖住,只有4C长时才可以看到。
5、洗膜的时间和温度。
6、ECL等的品牌,曝光时间等。 |
y*****1 发帖数: 73 | 13 protein degradation
solution: add more PI, lyse as quick as possible, as cold as possible |
k*******6 发帖数: 103 | 14 我不是很懂哈,原理上来说block是不是应该block膜上未结合蛋白的位点啊?所以
block不好是不是应该背景很脏,而不是出现非特异条带啊? |
c********r 发帖数: 6013 | |
c********r 发帖数: 6013 | |
c********r 发帖数: 6013 | |