K**********e
发帖数: 188 | 1 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
很干净，几乎没有非特异的带。在
我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
奶
他那个抗体是ChIP级的 人家都用来做ChIP了 效果很好。在我手里这个德性 哭死 |
b**2
发帖数: 1140 | 2 Blocking? BSA? Milk?
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
|
s******y
发帖数: 28562 | 3 你应该在同一个胶上放进一个positive control, one negative control.
然后再试一次。别人用的情况不能直接搬到你那里。
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
|
o**4
发帖数: 35028 | 4 block时间长一点，1小时吧，
然后就是二抗之后使劲洗，背景会好很多，我都是至少3次1小时的洗的
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
|
W****C
发帖数: 1937 | 5 你蛋白上样没加多了吧？你的抗体没变性吧？ 用前高速离心一下
你可以自己trouble shooting 啊 比如不加1抗 只加2抗看是不是很多带 |
o**4
发帖数: 35028 | 6 最好在4度冷室做western，室温抗体失活比较快（如果反复使用抗体的话）
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
|
n***w
发帖数: 2405 | 7 让我想起来那个印度阿三sabotage的故事。。。 |
p******i
发帖数: 1092 | 8 有没有可能你 转膜 的某些细节和别人不同？
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
|
s*****g
发帖数: 7857 | 9 洗的时间和TBST溶液的体积都有关。
多用TBST溶液，每次洗10分钟
显影时间长，背景就多。
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
|
v***a
发帖数: 1242 | 10 如果你们的抗体是同一lot的，并且是作为一抗重复使用的（假设其它条件都完全一致
），那你把你的用多了几次以后看看是否杂band会少点。
我曾遇到过有的抗体越用越干净的情况。刚用的几次会很脏。
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
|
|
|
c******r
发帖数: 3778 | 11 不知道你是新手还是老手？
大侠咱们不熟哈，这个问题要是冒犯请原谅哈。
我问这个的原因是如果是新手，那原因可能是很简单的，比如二抗之后是用PBS还是
milk洗的？二抗多用1：10000，不用自己调整。一般都调整一抗就可以了。。。可能是
些非常简单的原因哈
如果是千佬，跑的胶比别人吃的糕还多，那多半不是技术原因。。。比如，你的抗体值
钱不？能不能自己单独弄一份，或者偷偷跟别的实验室借一点？这个别人其他实验结果
怎么样？给出的结果是原片还是powerpoint？
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
|
C******r
发帖数: 790 | 12 我也是约来越不会做western了
在以前实验室，从没做过的三四个内源蛋白CoIP，一次就能做出来
现在实验室，这次有的信号（doublet磷酸化band）下次就没有了（只有脏背景，没有
条带），搞得我每次去显影都提心吊胆
即使cell line相同，抗体相同，稀释倍数相同，一个人western跟另一个人western不
一样的可能原因太多了，试着列举一下：
1、cell lysis buffer的离子强度和去污剂强度不同，裂解时间长短不同，导致你们
lysate里的蛋白种量有差异；至于要看磷酸化band的话，裂解液是否加phosphotate
inhibitor, 加的种类，也超级影响结果。我不加phosphotase inhibitor的话，有时候
可以看到band shift，但更多时候看不到。
2、SDS胶的浓度，Tris的浓度和pH；这个有人说有影响，我还没有比较过。
3、转膜的电流、时间、温度，以及转膜液里的离子强度（Tris和Glycine的量）,以及
是否加有SDS，都会影响转膜效果。个别抗体对转膜有没有SDS会很敏感，没有哪个配方
是绝对的好。
4、一抗和二抗的稀释倍率、时间长短、和温度条件。在你的case里，温度时间和稀释
都跟另外那个人相同，应该不是这一步的原因。eg.有些弱的信号，RT短时看不到，RT
长时就被背景盖住，只有4C长时才可以看到。
5、洗膜的时间和温度。
6、ECL等的品牌，曝光时间等。 |
y*****1
发帖数: 73 | 13 protein degradation
solution: add more PI, lyse as quick as possible, as cold as possible |
k*******6
发帖数: 103 | 14 我不是很懂哈，原理上来说block是不是应该block膜上未结合蛋白的位点啊？所以
block不好是不是应该背景很脏，而不是出现非特异条带啊？ |
c********r
发帖数: 6013 | |
c********r
发帖数: 6013 | |
c********r
发帖数: 6013 | |
