x********a
发帖数: 157 | 1 最近在做IP,我实验室没有人以前做过，包括老板自己也没有。我先后试了几个
protocol, 结果都很不理想，好像总是把其他的很多蛋白也给沉淀下去了，很不纯。有
一个问题我自己也注意到了，就是在bead+antibody+cell lysate co-incubate之后，
要洗涤的时候，我用 5000rpm 离心，可是bead似乎不怎么贴壁，将像悬浊液一样，我
试着把速度提到 8000rpm，结果还是那样。再高的速度我不敢试了。请问大家有没有这
个问题？谁有没有好用的protocol可以分享以下吗？先谢谢大家了。 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 这个一般是因为你的cell lysate 太浓了，或者有DNA没有打碎，导致
那些bead都浮起来了。如果可能的话把lysate用 buffer 再稀释一下。
实在不行的话用一般的column filter。
【在 x********a 的大作中提到】
: 最近在做IP,我实验室没有人以前做过，包括老板自己也没有。我先后试了几个
: protocol, 结果都很不理想，好像总是把其他的很多蛋白也给沉淀下去了，很不纯。有
: 一个问题我自己也注意到了，就是在bead+antibody+cell lysate co-incubate之后，
: 要洗涤的时候，我用 5000rpm 离心，可是bead似乎不怎么贴壁，将像悬浊液一样，我
: 试着把速度提到 8000rpm，结果还是那样。再高的速度我不敢试了。请问大家有没有这
: 个问题？谁有没有好用的protocol可以分享以下吗？先谢谢大家了。
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w*****n
发帖数: 310 | 3 5000rpm挺高了，可以先用bead吸一下lysate,离了上清再加antibody。
【在 x********a 的大作中提到】
: 最近在做IP,我实验室没有人以前做过，包括老板自己也没有。我先后试了几个
: protocol, 结果都很不理想，好像总是把其他的很多蛋白也给沉淀下去了，很不纯。有
: 一个问题我自己也注意到了，就是在bead+antibody+cell lysate co-incubate之后，
: 要洗涤的时候，我用 5000rpm 离心，可是bead似乎不怎么贴壁，将像悬浊液一样，我
: 试着把速度提到 8000rpm，结果还是那样。再高的速度我不敢试了。请问大家有没有这
: 个问题？谁有没有好用的protocol可以分享以下吗？先谢谢大家了。
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f******k
发帖数: 856 | 4 我离心用3000rpm就够了。你用什么溶液烈解细胞？
【在 x********a 的大作中提到】
: 最近在做IP,我实验室没有人以前做过，包括老板自己也没有。我先后试了几个
: protocol, 结果都很不理想，好像总是把其他的很多蛋白也给沉淀下去了，很不纯。有
: 一个问题我自己也注意到了，就是在bead+antibody+cell lysate co-incubate之后，
: 要洗涤的时候，我用 5000rpm 离心，可是bead似乎不怎么贴壁，将像悬浊液一样，我
: 试着把速度提到 8000rpm，结果还是那样。再高的速度我不敢试了。请问大家有没有这
: 个问题？谁有没有好用的protocol可以分享以下吗？先谢谢大家了。
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s******s
发帖数: 13035 | 5 嗯。估计lysate太黏了
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个一般是因为你的cell lysate 太浓了，或者有DNA没有打碎，导致
: 那些bead都浮起来了。如果可能的话把lysate用 buffer 再稀释一下。
: 实在不行的话用一般的column filter。
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V********n
发帖数: 305 | 6 俺的经验，蛋白浓度低的情况下，非特异性结合比较少。另，用些bead先pre-clean一
下lysate也可以减少非特异性结合。 |
F******p
发帖数: 2099 | |
x********a
发帖数: 157 | 8 谢谢大伙了，大部分人觉得问题在于lysate浓度，我用的是 1mg/ml，用少了又怕蛋白
出不来，请问哪个浓度比较合适？还有，我测浓度时用的 standard 是把 Albumin 粉
末溶解了，觉得从仪器上读的值很不稳定，大家一般怎么测的蛋白浓度呢？ |
x********a
发帖数: 157 | 9 我之前忘了说了，我在加抗体前有用bead 吸的。加了bead后一般静置 3 个小时，然后
离心，加抗体。
【在 w*****n 的大作中提到】
: 5000rpm挺高了，可以先用bead吸一下lysate,离了上清再加antibody。
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x********a
发帖数: 157 | 10 我的裂解液成分是：
50 mM Tris-HCl (Ph 7.4)
150 mM NaCl
2 mM EDTA
5% glycerol
1% Triton
然后每1毫升上述的液体加 10 ul 0.1M PMSF 和 20 ul Protein inhibitor cocktail.
【在 f******k 的大作中提到】
: 我离心用3000rpm就够了。你用什么溶液烈解细胞？
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x********a
发帖数: 157 | 11 我也有用bead 先沉淀一下，我的浓度是1 mg/ml, 老板说低了就出不来， 所以我一直
用这个浓度。请问你用过的比价低的但也不影响结果的浓度是多少呢？
【在 V********n 的大作中提到】
: 俺的经验，蛋白浓度低的情况下，非特异性结合比较少。另，用些bead先pre-clean一
: 下lysate也可以减少非特异性结合。
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m******5
发帖数: 1383 | 12 做co ip 不能用triton 的吧。。
【在 x********a 的大作中提到】
: 我也有用bead 先沉淀一下，我的浓度是1 mg/ml, 老板说低了就出不来， 所以我一直
: 用这个浓度。请问你用过的比价低的但也不影响结果的浓度是多少呢？
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V********n
发帖数: 305 | 13 这个听起来有些奇怪。首先，pre-clean也最好象做IP一样有晃动，不要让管子静止。
其次，我一般IP的做法是先用抗体包被beads，同时pre-clean蛋白，然后用clean过的
蛋白里加包被好的beads过夜。
蛋白浓度需要摸条件，如果非特异性高，就稀释。IP本来就有富集的作用。
【在 x********a 的大作中提到】
: 我之前忘了说了，我在加抗体前有用bead 吸的。加了bead后一般静置 3 个小时，然后
: 离心，加抗体。
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x********a
发帖数: 157 | 14 请问你有 protocol 吗？能不能发一份给我？ 谢谢！！！
【在 V********n 的大作中提到】
: 这个听起来有些奇怪。首先，pre-clean也最好象做IP一样有晃动，不要让管子静止。
: 其次，我一般IP的做法是先用抗体包被beads，同时pre-clean蛋白，然后用clean过的
: 蛋白里加包被好的beads过夜。
: 蛋白浓度需要摸条件，如果非特异性高，就稀释。IP本来就有富集的作用。
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S*******m
发帖数: 34 | 15 上超速离心吧. 100000g 1 hour.应该能解决问题.
【在 x********a 的大作中提到】
: 最近在做IP,我实验室没有人以前做过，包括老板自己也没有。我先后试了几个
: protocol, 结果都很不理想，好像总是把其他的很多蛋白也给沉淀下去了，很不纯。有
: 一个问题我自己也注意到了，就是在bead+antibody+cell lysate co-incubate之后，
: 要洗涤的时候，我用 5000rpm 离心，可是bead似乎不怎么贴壁，将像悬浊液一样，我
: 试着把速度提到 8000rpm，结果还是那样。再高的速度我不敢试了。请问大家有没有这
: 个问题？谁有没有好用的protocol可以分享以下吗？先谢谢大家了。
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x********a
发帖数: 157 | 16 没问题吧？这样我光洗涤3次就要花好几个小时呢。
【在 S*******m 的大作中提到】
: 上超速离心吧. 100000g 1 hour.应该能解决问题.
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V********n
发帖数: 305 | 17 IP需要低速离心，高速会损害agarose的结构，破坏蛋白结合。 |
f******k
发帖数: 856 | 18 triton裂解完的溶液就是很浓稠，我不建议用，建议你换NP40，或者IGAPAL
cocktail.
【在 x********a 的大作中提到】
: 我的裂解液成分是：
: 50 mM Tris-HCl (Ph 7.4)
: 150 mM NaCl
: 2 mM EDTA
: 5% glycerol
: 1% Triton
: 然后每1毫升上述的液体加 10 ul 0.1M PMSF 和 20 ul Protein inhibitor cocktail.
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x********a
发帖数: 157 | 19 谢谢， 我换一下看看。Happy Thanksgiving.
【在 f******k 的大作中提到】
: triton裂解完的溶液就是很浓稠，我不建议用，建议你换NP40，或者IGAPAL
:
: cocktail.
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m*****l
发帖数: 28 | 20 给你个trick， 解决裂解后lysate太粘的问题。
用sonication， 低点的level稍微打一下 |
c******k
发帖数: 252 | 21 不知道lz用的是什么bead
我用的protein G from GE
用14000rpm
work 的很好 |
s******s
发帖数: 13035 | 22 我觉得太黏了就是体积太小，加个五倍十倍就没有问题了。
【在 m*****l 的大作中提到】
: 给你个trick， 解决裂解后lysate太粘的问题。
: 用sonication， 低点的level稍微打一下
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