s********n
发帖数: 248 | 1 M-CSF培养的bone marrow macrophage，stimulate以后western blot 磷酸化的AKT/ERK
/STAT1，其他两个都blot的很好，但是pAKT总是没有想要的带，貌似出来的带都是二抗
结合的非特异性带。
请问版上高人，有blot过pAKT的没有？能否帮我看看问题出在什么地方了啊？
我用的WASHING BUFFER是TBST with 0.05%Tween 20，
BLOCKING BUFFER:5%BSA/TBST,
一抗就dilute在blocking buffer里边。
protocol:
室温block 1h，一抗4度过夜，洗3次×10min；二抗室温30min，洗3次×15min。
我初步怀疑是tween 20量加多了，又看到班上有用pbs做washing buffer的，貌似pbs更
温和一些，不知道用pbs会不会好一些？
小女子多谢了先！ |
h*******o
发帖数: 4884 | 2 pAKT antibody from cell signaling works great for me |
b********i
发帖数: 73 | 3 Depending on your stimuli, p-Akt may not be high enough. Another trick, use Femto, not Pico, to develop
your membrane. This issue is about how much p-Akt in your system, but not Ab issue.
ERK
【在 s********n 的大作中提到】
: M-CSF培养的bone marrow macrophage，stimulate以后western blot 磷酸化的AKT/ERK
: /STAT1，其他两个都blot的很好，但是pAKT总是没有想要的带，貌似出来的带都是二抗
: 结合的非特异性带。
: 请问版上高人，有blot过pAKT的没有？能否帮我看看问题出在什么地方了啊？
: 我用的WASHING BUFFER是TBST with 0.05%Tween 20，
: BLOCKING BUFFER:5%BSA/TBST,
: 一抗就dilute在blocking buffer里边。
: protocol:
: 室温block 1h，一抗4度过夜，洗3次×10min；二抗室温30min，洗3次×15min。
: 我初步怀疑是tween 20量加多了，又看到班上有用pbs做washing buffer的，貌似pbs更
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y***i
发帖数: 11639 | 4 听起来是一抗质量问题。
ERK
【在 s********n 的大作中提到】
: M-CSF培养的bone marrow macrophage，stimulate以后western blot 磷酸化的AKT/ERK
: /STAT1，其他两个都blot的很好，但是pAKT总是没有想要的带，貌似出来的带都是二抗
: 结合的非特异性带。
: 请问版上高人，有blot过pAKT的没有？能否帮我看看问题出在什么地方了啊？
: 我用的WASHING BUFFER是TBST with 0.05%Tween 20，
: BLOCKING BUFFER:5%BSA/TBST,
: 一抗就dilute在blocking buffer里边。
: protocol:
: 室温block 1h，一抗4度过夜，洗3次×10min；二抗室温30min，洗3次×15min。
: 我初步怀疑是tween 20量加多了，又看到班上有用pbs做washing buffer的，貌似pbs更
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s*********s
发帖数: 110 | 5 cell signaling的pAKT(473) antibody应该没有问题
有可能的问题
1.抗体坏了
buy new antibody
2.收细胞的过程中dephosphorylation了
A.adding phosphatase inhibitor in your lysis buffer and do everything
quick on ice
B.终极解决方案
do duplicate plates
one plate is used for normalizing protein concentration
another plate directly lyzed with sampling buffer, in this way, you can
preserve all phosphorylation
ERK
【在 s********n 的大作中提到】
: M-CSF培养的bone marrow macrophage，stimulate以后western blot 磷酸化的AKT/ERK
: /STAT1，其他两个都blot的很好，但是pAKT总是没有想要的带，貌似出来的带都是二抗
: 结合的非特异性带。
: 请问版上高人，有blot过pAKT的没有？能否帮我看看问题出在什么地方了啊？
: 我用的WASHING BUFFER是TBST with 0.05%Tween 20，
: BLOCKING BUFFER:5%BSA/TBST,
: 一抗就dilute在blocking buffer里边。
: protocol:
: 室温block 1h，一抗4度过夜，洗3次×10min；二抗室温30min，洗3次×15min。
: 我初步怀疑是tween 20量加多了，又看到班上有用pbs做washing buffer的，貌似pbs更
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s********n
发帖数: 248 | 6 请问您的protocol和buffer都和我有什么不一样的么？
我用100u/ml IFN beta stimulated, 对macrophage绝对应该能让AKT磷酸化了啊。
【在 h*******o 的大作中提到】
: pAKT antibody from cell signaling works great for me
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s********n
发帖数: 248 | 7 我用100U/ml IFN beta stimulte的，应该会诱导大量pAKT的啊。
use Femto, not Pico, to develop
Ab issue.
【在 b********i 的大作中提到】
: Depending on your stimuli, p-Akt may not be high enough. Another trick, use Femto, not Pico, to develop
: your membrane. This issue is about how much p-Akt in your system, but not Ab issue.
:
: ERK
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b*****l
发帖数: 9499 | 8 有 positive control 么？
ERK
【在 s********n 的大作中提到】
: M-CSF培养的bone marrow macrophage，stimulate以后western blot 磷酸化的AKT/ERK
: /STAT1，其他两个都blot的很好，但是pAKT总是没有想要的带，貌似出来的带都是二抗
: 结合的非特异性带。
: 请问版上高人，有blot过pAKT的没有？能否帮我看看问题出在什么地方了啊？
: 我用的WASHING BUFFER是TBST with 0.05%Tween 20，
: BLOCKING BUFFER:5%BSA/TBST,
: 一抗就dilute在blocking buffer里边。
: protocol:
: 室温block 1h，一抗4度过夜，洗3次×10min；二抗室温30min，洗3次×15min。
: 我初步怀疑是tween 20量加多了，又看到班上有用pbs做washing buffer的，貌似pbs更
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j********r
发帖数: 156 | 9 You might just set up a positive control (like any cultured fibroblasts
or epithelial cells, starved of serum then treated with serum or other
defined factors for short time).
If you have no problem with pMAPK or pStat3, as other already pointed
out, pAkt in your cells might be too low to be detected.
By the way, how does IFN-beta activates PI3K or Akt? Thanks
【在 s********n 的大作中提到】
: 请问您的protocol和buffer都和我有什么不一样的么？
: 我用100u/ml IFN beta stimulated, 对macrophage绝对应该能让AKT磷酸化了啊。
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s********n
发帖数: 248 | 10 IFNAR1 dependent pi3k activation，具体signaling pathway不知道。
多谢大侠指点！
【在 j********r 的大作中提到】
: You might just set up a positive control (like any cultured fibroblasts
: or epithelial cells, starved of serum then treated with serum or other
: defined factors for short time).
: If you have no problem with pMAPK or pStat3, as other already pointed
: out, pAkt in your cells might be too low to be detected.
: By the way, how does IFN-beta activates PI3K or Akt? Thanks
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h*******n
发帖数: 2052 | 11 which p-akt antibody are you using now? |
