D***y 发帖数: 693 | 1 最近开始用293Tproduce lentivirus,收集上清后过0.45um filter,然后Infect cells
。24小时后check GFP,只有很少的细胞gfp positive的,而且是一簇一簇的。看形态
像293T细胞,想问各位一下:0.45um filter 能把293T去掉吗?
多谢! |
p******d 发帖数: 3737 | |
T********e 发帖数: 223 | |
l******g 发帖数: 1623 | 4 293T 平均16个micron,过不了filter的。过滤完你看一下就知道了。
你看到的是你后来感染的细胞吧?
cells
【在 D***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近开始用293Tproduce lentivirus,收集上清后过0.45um filter,然后Infect cells : 。24小时后check GFP,只有很少的细胞gfp positive的,而且是一簇一簇的。看形态 : 像293T细胞,想问各位一下:0.45um filter 能把293T去掉吗? : 多谢!
|
D***y 发帖数: 693 | 5 非常感谢大家的回复。看起来可能是后来感染的细胞。但是就是形态比较怪
【在 l******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 293T 平均16个micron,过不了filter的。过滤完你看一下就知道了。 : 你看到的是你后来感染的细胞吧? : : cells
|
D***y 发帖数: 693 | 6 非常感谢大家的回复。看起来可能是后来感染的细胞。但是就是形态比较怪
【在 l******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 293T 平均16个micron,过不了filter的。过滤完你看一下就知道了。 : 你看到的是你后来感染的细胞吧? : : cells
|
j****x 发帖数: 1704 | 7 如果用的是VSVG,那么这种形态是非常典型的,多个细胞聚集成团,形态变圆,
由于VSVG的细胞毒性造成的。
不过看来你的包转效率不够高啊,否则的话感染之后一般满屏都是阳性细胞根本
不用去怀疑是不是没有被过滤掉的273T
【在 D***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 非常感谢大家的回复。看起来可能是后来感染的细胞。但是就是形态比较怪
|
D***y 发帖数: 693 | 8 用的是vsvg。不知道为什么包转效率很低。转293T后看了一下gfp,很多细胞是positive
的。
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果用的是VSVG,那么这种形态是非常典型的,多个细胞聚集成团,形态变圆, : 由于VSVG的细胞毒性造成的。 : 不过看来你的包转效率不够高啊,否则的话感染之后一般满屏都是阳性细胞根本 : 不用去怀疑是不是没有被过滤掉的273T
|
h***l 发帖数: 168 | 9 concentrate your virus soup via ultracentrifugation or PEG will help. |
B******o 发帖数: 496 | 10 病毒感染细胞也要一段时间才能表达的
一般2-3天才会有GFP出来。24小时太短了些
多留一会儿才能比较准确的知道virus titer如何
cells
【在 D***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近开始用293Tproduce lentivirus,收集上清后过0.45um filter,然后Infect cells : 。24小时后check GFP,只有很少的细胞gfp positive的,而且是一簇一簇的。看形态 : 像293T细胞,想问各位一下:0.45um filter 能把293T去掉吗? : 多谢!
|
|
|
b******k 发帖数: 1874 | 11 gfp usually only take overnight to get expressed, if use cmv promoter
【在 B******o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 病毒感染细胞也要一段时间才能表达的 : 一般2-3天才会有GFP出来。24小时太短了些 : 多留一会儿才能比较准确的知道virus titer如何 : : cells
|
B******o 发帖数: 496 | 12 你说的plasmid转染还是病毒感染?
lentivirus从感染细胞到整合到基因组到表达蛋白都需要时间
你能给个24时就能看的reference么?
俺先给俺的吧。System biosciences的protocol明确写了3天。Openbiosystems明确写
的2天。自己的经历也是至少2天。无论是CMV,PGK,or MMLV promoter。
【在 b******k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : gfp usually only take overnight to get expressed, if use cmv promoter
|
D***y 发帖数: 693 | 13 GFP 24小时应该够了。我转染后20个小时左右check,已经有很强的信号。
我用的是FUW的lentivirus vector.板上不知道有没有人用过?
【在 b******k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : gfp usually only take overnight to get expressed, if use cmv promoter
|
B******o 发帖数: 496 | 14 你问题里提到的24小时候之看到很少的细胞是GFP+。 这是infected的吧?
infected cells need at least 2 days to express the transgenes. 如果你仅仅在
24小时后就去check GFP,很难看到positive的细胞。应该多留一下,过一天再看,才
能知道你的virus titer到底如何。
如果2-3天后,infected的细胞里GFP+的还很少。那么说明你virus titer很低。这时候
你得去查是不是transfection效率不够,如果不是,那么说明你的packaging plasmid
或者packaging cells不好。
【在 D***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : GFP 24小时应该够了。我转染后20个小时左右check,已经有很强的信号。 : 我用的是FUW的lentivirus vector.板上不知道有没有人用过?
|
j****x 发帖数: 1704 | 15 “很多”是不够的,基本上293T转染的效率应该达到至少90%以上
positive
【在 D***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用的是vsvg。不知道为什么包转效率很低。转293T后看了一下gfp,很多细胞是positive : 的。
|
j****x 发帖数: 1704 | 16 我上过流式,24小时之后确实就能检测到,不过信号相对很弱,48小时肯定就没问题了。
这也和细胞系有一定关系
【在 B******o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你说的plasmid转染还是病毒感染? : lentivirus从感染细胞到整合到基因组到表达蛋白都需要时间 : 你能给个24时就能看的reference么? : 俺先给俺的吧。System biosciences的protocol明确写了3天。Openbiosystems明确写 : 的2天。自己的经历也是至少2天。无论是CMV,PGK,or MMLV promoter。
|
L**********O 发帖数: 1761 | 17 yes~~~
0.45um filter 能把293T去掉吗?
【在 D***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : GFP 24小时应该够了。我转染后20个小时左右check,已经有很强的信号。 : 我用的是FUW的lentivirus vector.板上不知道有没有人用过?
|
T********e 发帖数: 223 | 18 用过FUGW的 lentiviru, 不知道和FUW是不是类似的,确实是gfp表达很快,信号强。不
管原代细胞还是细胞系,加入病毒
overnight就可以在显微镜下看到荧光。
【在 D***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : GFP 24小时应该够了。我转染后20个小时左右check,已经有很强的信号。 : 我用的是FUW的lentivirus vector.板上不知道有没有人用过?
|
d*p 发帖数: 534 | 19 what you saw might be cell debris. They are GFP positive and attach to cells
. Check it at 48 hr. |
C*****h 发帖数: 926 | 20 filter之后,在benchtop centrifuge里,离心10秒钟,去处少量debris
cells
【在 D***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近开始用293Tproduce lentivirus,收集上清后过0.45um filter,然后Infect cells : 。24小时后check GFP,只有很少的细胞gfp positive的,而且是一簇一簇的。看形态 : 像293T细胞,想问各位一下:0.45um filter 能把293T去掉吗? : 多谢!
|
|
|
P******r 发帖数: 11 | 21 我的理解Lentivirus 是慢的,不会很快见到GFP。摘自维基百科:
Lentivirus (lenti-, Latin for "slow") is a genus of slow viruses of the
Retroviridae family, characterized by a long incubation period. Lentiviruses
can deliver a significant amount of genetic information into the DNA of the
host cell and have the unique ability among retroviruses of being able to
replicate in non-dividing cells。 |
D***y 发帖数: 693 | 22 我们用的是一样的。能告诉一下你用的什么packing 和envelop vector吗?
【在 T********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用过FUGW的 lentiviru, 不知道和FUW是不是类似的,确实是gfp表达很快,信号强。不 : 管原代细胞还是细胞系,加入病毒 : overnight就可以在显微镜下看到荧光。
|
T********e 发帖数: 223 | 23 暂时找不到具体的vector图谱。
我们用三个helper vector:p-gag/pol; p-vsvg; prsv-rev。不知道有没有帮助
【在 D***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我们用的是一样的。能告诉一下你用的什么packing 和envelop vector吗?
|