D***y
发帖数: 693 | 1 最近开始用293Tproduce lentivirus，收集上清后过0.45um filter,然后Infect cells
。24小时后check GFP，只有很少的细胞gfp positive的，而且是一簇一簇的。看形态
像293T细胞，想问各位一下：0.45um filter 能把293T去掉吗？
多谢！ |
p******d
发帖数: 3737 | |
T********e
发帖数: 223 | |
l******g
发帖数: 1623 | 4 293T 平均16个micron，过不了filter的。过滤完你看一下就知道了。
你看到的是你后来感染的细胞吧？
cells
【在 D***y 的大作中提到】
: 最近开始用293Tproduce lentivirus，收集上清后过0.45um filter,然后Infect cells
: 。24小时后check GFP，只有很少的细胞gfp positive的，而且是一簇一簇的。看形态
: 像293T细胞，想问各位一下：0.45um filter 能把293T去掉吗？
: 多谢！
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D***y
发帖数: 693 | 5 非常感谢大家的回复。看起来可能是后来感染的细胞。但是就是形态比较怪
【在 l******g 的大作中提到】
: 293T 平均16个micron，过不了filter的。过滤完你看一下就知道了。
: 你看到的是你后来感染的细胞吧？
:
: cells
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D***y
发帖数: 693 | 6 非常感谢大家的回复。看起来可能是后来感染的细胞。但是就是形态比较怪
【在 l******g 的大作中提到】
: 293T 平均16个micron，过不了filter的。过滤完你看一下就知道了。
: 你看到的是你后来感染的细胞吧？
:
: cells
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j****x
发帖数: 1704 | 7 如果用的是VSVG，那么这种形态是非常典型的，多个细胞聚集成团，形态变圆，
由于VSVG的细胞毒性造成的。
不过看来你的包转效率不够高啊，否则的话感染之后一般满屏都是阳性细胞根本
不用去怀疑是不是没有被过滤掉的273T
【在 D***y 的大作中提到】
: 非常感谢大家的回复。看起来可能是后来感染的细胞。但是就是形态比较怪
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D***y
发帖数: 693 | 8 用的是vsvg。不知道为什么包转效率很低。转293T后看了一下gfp,很多细胞是positive
的。
【在 j****x 的大作中提到】
: 如果用的是VSVG，那么这种形态是非常典型的，多个细胞聚集成团，形态变圆，
: 由于VSVG的细胞毒性造成的。
: 不过看来你的包转效率不够高啊，否则的话感染之后一般满屏都是阳性细胞根本
: 不用去怀疑是不是没有被过滤掉的273T
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h***l
发帖数: 168 | 9 concentrate your virus soup via ultracentrifugation or PEG will help. |
B******o
发帖数: 496 | 10 病毒感染细胞也要一段时间才能表达的
一般2-3天才会有GFP出来。24小时太短了些
多留一会儿才能比较准确的知道virus titer如何
cells
【在 D***y 的大作中提到】
: 最近开始用293Tproduce lentivirus，收集上清后过0.45um filter,然后Infect cells
: 。24小时后check GFP，只有很少的细胞gfp positive的，而且是一簇一簇的。看形态
: 像293T细胞，想问各位一下：0.45um filter 能把293T去掉吗？
: 多谢！
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b******k
发帖数: 1874 | 11 gfp usually only take overnight to get expressed, if use cmv promoter
【在 B******o 的大作中提到】
: 病毒感染细胞也要一段时间才能表达的
: 一般2-3天才会有GFP出来。24小时太短了些
: 多留一会儿才能比较准确的知道virus titer如何
:
: cells
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B******o
发帖数: 496 | 12 你说的plasmid转染还是病毒感染？
lentivirus从感染细胞到整合到基因组到表达蛋白都需要时间
你能给个24时就能看的reference么？
俺先给俺的吧。System biosciences的protocol明确写了3天。Openbiosystems明确写
的2天。自己的经历也是至少2天。无论是CMV,PGK,or MMLV promoter。
【在 b******k 的大作中提到】
: gfp usually only take overnight to get expressed, if use cmv promoter
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D***y
发帖数: 693 | 13 GFP 24小时应该够了。我转染后20个小时左右check，已经有很强的信号。
我用的是FUW的lentivirus vector.板上不知道有没有人用过？
【在 b******k 的大作中提到】
: gfp usually only take overnight to get expressed, if use cmv promoter
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B******o
发帖数: 496 | 14 你问题里提到的24小时候之看到很少的细胞是GFP+。 这是infected的吧？
infected cells need at least 2 days to express the transgenes. 如果你仅仅在
24小时后就去check GFP，很难看到positive的细胞。应该多留一下，过一天再看，才
能知道你的virus titer到底如何。
如果2-3天后，infected的细胞里GFP+的还很少。那么说明你virus titer很低。这时候
你得去查是不是transfection效率不够，如果不是，那么说明你的packaging plasmid
或者packaging cells不好。
【在 D***y 的大作中提到】
: GFP 24小时应该够了。我转染后20个小时左右check，已经有很强的信号。
: 我用的是FUW的lentivirus vector.板上不知道有没有人用过？
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j****x
发帖数: 1704 | 15 “很多”是不够的，基本上293T转染的效率应该达到至少90%以上
positive
【在 D***y 的大作中提到】
: 用的是vsvg。不知道为什么包转效率很低。转293T后看了一下gfp,很多细胞是positive
: 的。
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j****x
发帖数: 1704 | 16 我上过流式，24小时之后确实就能检测到，不过信号相对很弱，48小时肯定就没问题了。
这也和细胞系有一定关系
【在 B******o 的大作中提到】
: 你说的plasmid转染还是病毒感染？
: lentivirus从感染细胞到整合到基因组到表达蛋白都需要时间
: 你能给个24时就能看的reference么？
: 俺先给俺的吧。System biosciences的protocol明确写了3天。Openbiosystems明确写
: 的2天。自己的经历也是至少2天。无论是CMV,PGK,or MMLV promoter。
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L**********O
发帖数: 1761 | 17 yes~~~
0.45um filter 能把293T去掉吗？
【在 D***y 的大作中提到】
: GFP 24小时应该够了。我转染后20个小时左右check，已经有很强的信号。
: 我用的是FUW的lentivirus vector.板上不知道有没有人用过？
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T********e
发帖数: 223 | 18 用过FUGW的 lentiviru, 不知道和FUW是不是类似的，确实是gfp表达很快，信号强。不
管原代细胞还是细胞系，加入病毒
overnight就可以在显微镜下看到荧光。
【在 D***y 的大作中提到】
: GFP 24小时应该够了。我转染后20个小时左右check，已经有很强的信号。
: 我用的是FUW的lentivirus vector.板上不知道有没有人用过？
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d*p
发帖数: 534 | 19 what you saw might be cell debris. They are GFP positive and attach to cells
. Check it at 48 hr. |
C*****h
发帖数: 926 | 20 filter之后，在benchtop centrifuge里，离心10秒钟，去处少量debris
cells
【在 D***y 的大作中提到】
: 最近开始用293Tproduce lentivirus，收集上清后过0.45um filter,然后Infect cells
: 。24小时后check GFP，只有很少的细胞gfp positive的，而且是一簇一簇的。看形态
: 像293T细胞，想问各位一下：0.45um filter 能把293T去掉吗？
: 多谢！
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P******r
发帖数: 11 | 21 我的理解Lentivirus 是慢的，不会很快见到GFP。摘自维基百科：
Lentivirus (lenti-, Latin for "slow") is a genus of slow viruses of the
Retroviridae family, characterized by a long incubation period. Lentiviruses
can deliver a significant amount of genetic information into the DNA of the
host cell and have the unique ability among retroviruses of being able to
replicate in non-dividing cells。 |
D***y
发帖数: 693 | 22 我们用的是一样的。能告诉一下你用的什么packing 和envelop vector吗？
【在 T********e 的大作中提到】
: 用过FUGW的 lentiviru, 不知道和FUW是不是类似的，确实是gfp表达很快，信号强。不
: 管原代细胞还是细胞系，加入病毒
: overnight就可以在显微镜下看到荧光。
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T********e
发帖数: 223 | 23 暂时找不到具体的vector图谱。
我们用三个helper vector：p-gag／pol； p-vsvg; prsv－rev。不知道有没有帮助
【在 D***y 的大作中提到】
: 我们用的是一样的。能告诉一下你用的什么packing 和envelop vector吗？
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