E****A 发帖数: 184 | 1 如果一条mRNA在第一个和第二个exon上分别有一个AUG,并且有完整的ORF,只是ORF1比
ORF2多出几十个氨基酸,剩余的氨基酸序列完全相同。请问,这条mRNA在细胞里被翻译
时会从哪个AUG上开始翻译?会同时被翻译成两条多肽链吗?
看一些文章说upstream ORF会影响翻译。到底怎么一个影响法呢?
多谢讨论! |
W****C 发帖数: 1937 | |
E****A 发帖数: 184 | 3 我不是要检测RNA有没有表达啊,是想知道有没有两条蛋白表达。如果有表达的话,为
什么需要表达两条蛋白?怎么分析多出来的那几十个氨基酸的作用呢?
【在 W****C 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 当然有可能, RTPCR测一下不就确认啦?
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n***w 发帖数: 2405 | 4 where does the polymerase bind? If it binds in the promoter region in front
of the first ORF, then it should translate the full-length protein. Don't
worry about the second one.
You may need to look up "internal ribosome entry site (IRES)" to answer your
second question.
Above is my opinion. |
j****x 发帖数: 1704 | 5 和原核mRNA不一样,真核mRNA的翻译并不遵守“第一AUG”原则,所以同一条mRNA翻译
出不同的产物很常见(即使不存在IRES的情况下),尤其在病毒编码的mRNA中更是普遍。
首先检查一下,你这2个AUG,是否都符合Kozak consensus规则,简言之如果-3位为A且
/或+4位为G的话,那么该AUG可用为翻译起始的可能性很大,这样的AUG如果在5'UTR 区
域中存在甚至还不止一个的话,那么自然对正常的ORF翻译有竞争性(核糖体)的副作
用了。这就是所谓upstream ORF的负效应。
【在 E****A 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果一条mRNA在第一个和第二个exon上分别有一个AUG,并且有完整的ORF,只是ORF1比 : ORF2多出几十个氨基酸,剩余的氨基酸序列完全相同。请问,这条mRNA在细胞里被翻译 : 时会从哪个AUG上开始翻译?会同时被翻译成两条多肽链吗? : 看一些文章说upstream ORF会影响翻译。到底怎么一个影响法呢? : 多谢讨论!
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W****C 发帖数: 1937 | 6 没有rna, 就不会有蛋白啊,
要直接测比较麻烦。如果有识别C端的单抗的话WB也可以看到两条带啊, 或者你把整个
promoter+gene克隆, C端再加tag, 看看有没有两条带啊。 这种variant很多, 可能
会有稳定性/分部/功能的差别。
【在 E****A 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我不是要检测RNA有没有表达啊,是想知道有没有两条蛋白表达。如果有表达的话,为 : 什么需要表达两条蛋白?怎么分析多出来的那几十个氨基酸的作用呢?
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V********n 发帖数: 305 | 7 个人建议:
1)搞个蛋白电泳看是否有两种肽,没有抗体就加Tag。先搞清楚是否有问题存在。
2)如果确实有两种肽,分析未表达的序列里面的氨基酸组成。重点是磷酸化位点,疏
水氨基酸等,找线索分析功能差异。
3)造成上游AUG不能100%利用的原因很多。比如不在最佳Kozak consensus里,
IRES,上游AUG所在位置有特殊高级结构等等。
总之,先要确定问题是否存在。 |
C*****h 发帖数: 926 | 8 如果是真核生物,应该从第一个AUG翻译,第二个AUG基本上不会翻译。
【在 E****A 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果一条mRNA在第一个和第二个exon上分别有一个AUG,并且有完整的ORF,只是ORF1比 : ORF2多出几十个氨基酸,剩余的氨基酸序列完全相同。请问,这条mRNA在细胞里被翻译 : 时会从哪个AUG上开始翻译?会同时被翻译成两条多肽链吗? : 看一些文章说upstream ORF会影响翻译。到底怎么一个影响法呢? : 多谢讨论!
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b****r 发帖数: 17995 | 9 second this
遍。
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 和原核mRNA不一样,真核mRNA的翻译并不遵守“第一AUG”原则,所以同一条mRNA翻译 : 出不同的产物很常见(即使不存在IRES的情况下),尤其在病毒编码的mRNA中更是普遍。 : 首先检查一下,你这2个AUG,是否都符合Kozak consensus规则,简言之如果-3位为A且 : /或+4位为G的话,那么该AUG可用为翻译起始的可能性很大,这样的AUG如果在5'UTR 区 : 域中存在甚至还不止一个的话,那么自然对正常的ORF翻译有竞争性(核糖体)的副作 : 用了。这就是所谓upstream ORF的负效应。
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E****A 发帖数: 184 | 10 thx for yr opinion. but why do u think that translation doesn't start from
the AUG in the sencond exon? is there any proof?
front
your
【在 n***w 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : where does the polymerase bind? If it binds in the promoter region in front : of the first ORF, then it should translate the full-length protein. Don't : worry about the second one. : You may need to look up "internal ribosome entry site (IRES)" to answer your : second question. : Above is my opinion.
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E****A 发帖数: 184 | 11 多谢你的见解。
刚才在wiki里看到你说的Kozak consensus是(gcc)gccRccAUGG,R可以是A也可以是G。
查了下两个AUG都符合。你说对正常的ORF有竞争性是指下游的ORF不会被翻译还是翻译
会变弱?
其实我刚开始的帖子里没有完全说出来,在1st exon和2nd exon中间有个alternative
first exon。这个alternative first exon所属的mRNA只有在2nd exon上有AUG,这个
2nd exon和上面那条mRNA的2nd exon是一样的。这么说,1st exon上的AUG会对这条
alternative 1st exon所属的mRNA的翻译产生抑制作用?有文章说明这种抑制作用的强
弱吗?
多谢。
遍。
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 和原核mRNA不一样,真核mRNA的翻译并不遵守“第一AUG”原则,所以同一条mRNA翻译 : 出不同的产物很常见(即使不存在IRES的情况下),尤其在病毒编码的mRNA中更是普遍。 : 首先检查一下,你这2个AUG,是否都符合Kozak consensus规则,简言之如果-3位为A且 : /或+4位为G的话,那么该AUG可用为翻译起始的可能性很大,这样的AUG如果在5'UTR 区 : 域中存在甚至还不止一个的话,那么自然对正常的ORF翻译有竞争性(核糖体)的副作 : 用了。这就是所谓upstream ORF的负效应。
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E****A 发帖数: 184 | 12 嗯,明白,多谢!
【在 W****C 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 没有rna, 就不会有蛋白啊, : 要直接测比较麻烦。如果有识别C端的单抗的话WB也可以看到两条带啊, 或者你把整个 : promoter+gene克隆, C端再加tag, 看看有没有两条带啊。 这种variant很多, 可能 : 会有稳定性/分部/功能的差别。
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E****A 发帖数: 184 | 13 多谢指导!
那怎么分析磷酸化位点,疏水氨基酸等功能差异呢?
【在 V********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 个人建议: : 1)搞个蛋白电泳看是否有两种肽,没有抗体就加Tag。先搞清楚是否有问题存在。 : 2)如果确实有两种肽,分析未表达的序列里面的氨基酸组成。重点是磷酸化位点,疏 : 水氨基酸等,找线索分析功能差异。 : 3)造成上游AUG不能100%利用的原因很多。比如不在最佳Kozak consensus里, : IRES,上游AUG所在位置有特殊高级结构等等。 : 总之,先要确定问题是否存在。
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w*******d 发帖数: 396 | |
E****A 发帖数: 184 | 15 嗯,多谢讨论
【在 w*******d 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 分别把这两个AUG突变了看看。
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f*******7 发帖数: 1019 | |
Z**********g 发帖数: 222 | 17 既然有alternative first exon,那就是可能有两条mRNA存在了.先RT-PCR一下,确定是
哪条mRNA(first exon or alternative first exon),如果只存在alternative first
exon的transcript,哪还有什么问题吗?如果只存在first exon的transcript,那就的检
测蛋白水平了,看哪个AUG起始翻译的.
alternative
【在 E****A 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 多谢你的见解。 : 刚才在wiki里看到你说的Kozak consensus是(gcc)gccRccAUGG,R可以是A也可以是G。 : 查了下两个AUG都符合。你说对正常的ORF有竞争性是指下游的ORF不会被翻译还是翻译 : 会变弱? : 其实我刚开始的帖子里没有完全说出来,在1st exon和2nd exon中间有个alternative : first exon。这个alternative first exon所属的mRNA只有在2nd exon上有AUG,这个 : 2nd exon和上面那条mRNA的2nd exon是一样的。这么说,1st exon上的AUG会对这条 : alternative 1st exon所属的mRNA的翻译产生抑制作用?有文章说明这种抑制作用的强 : 弱吗? : 多谢。
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E****A 发帖数: 184 | |
E****A 发帖数: 184 | 19 多谢!
RT-PCR和Northern blot验证了两条mRNA的存在。
看了楼上的PNAS文章,说uORFs correlate with significantly
reduced protein expression of the downstream ORF.
不知first exon的uORF会不会对alternative first exon的ORF产生啥影响或抑制作用
呢?
【在 Z**********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 既然有alternative first exon,那就是可能有两条mRNA存在了.先RT-PCR一下,确定是 : 哪条mRNA(first exon or alternative first exon),如果只存在alternative first : exon的transcript,哪还有什么问题吗?如果只存在first exon的transcript,那就的检 : 测蛋白水平了,看哪个AUG起始翻译的. : : alternative
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Z**********g 发帖数: 222 | 20 1. first exon和alternative first exon是两条独立的mRNA(非alternate splicing
,而是由不同的promoter产生的transcript),彼此的ORF应该不会影响吧.你的point应
该就是你刚开始说的,在first exon的mRNA上的前后两AUG会不会彼此影响。
2. 你怎么知道first exon AUG是uORF?uORF的确定是居于功能实验的(如果你确定了
细胞中该蛋白是由第二个AUG起始的翻译产物,你才可以称first exon AUG是uORF)。
事实上,我们知道AUG编码methionine,一个蛋白中前前后后methionine多的是,绝大
部分不能起始翻译嘛!
【在 E****A 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 多谢! : RT-PCR和Northern blot验证了两条mRNA的存在。 : 看了楼上的PNAS文章,说uORFs correlate with significantly : reduced protein expression of the downstream ORF. : 不知first exon的uORF会不会对alternative first exon的ORF产生啥影响或抑制作用 : 呢?
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E****A 发帖数: 184 | 21 多谢你的讨论!
1.我明白first exon和alternative first exon是由不同promoter产生的两条独立mRNA
,不过也
想知道彼此的orf会不会有影响。
2.我确实不确定first exon aug是uorf,不过只是第二个aug起始的orf是最早被克隆出
来当做
coding sequence的(跟human中的一样),后来通过找est才发现的first exon和
alternative
first exon。mrna里确实有很多aug,不过只有这两个aug能被翻译啊。。
期待更多讨论和见解。
splicing
【在 Z**********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 1. first exon和alternative first exon是两条独立的mRNA(非alternate splicing : ,而是由不同的promoter产生的transcript),彼此的ORF应该不会影响吧.你的point应 : 该就是你刚开始说的,在first exon的mRNA上的前后两AUG会不会彼此影响。 : 2. 你怎么知道first exon AUG是uORF?uORF的确定是居于功能实验的(如果你确定了 : 细胞中该蛋白是由第二个AUG起始的翻译产物,你才可以称first exon AUG是uORF)。 : 事实上,我们知道AUG编码methionine,一个蛋白中前前后后methionine多的是,绝大 : 部分不能起始翻译嘛!
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