L**********O
发帖数: 1761 | 1 我用promega的。
做triplicate，结果３值差异好大。Firefly一般background有30左右,而实验组也只有
30左右. Renillia一般比较正常,在１００ 左右。。
谢谢!~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ |
Z******5
发帖数: 435 | 2 你这个值也太低了吧。读数大小和荧光收集时间的设置有关，我一般设置收集2秒，自
己用移液枪加液（没钱，剩），每次就测3个well的。具体：
背景值：黑板40左右，白板100左右
Firely的值从几万（转染效率低的细胞）到几千万（293T细胞）；Renilia的值从几百
到几万（我用的是pRL-TK载体做内参，转的相对较少）
你的明显有问题（当然前提是问题不是出在你用的promoter上），建议你在你用的cell
line和293细胞中同时转染pGL3 control，pGL3 Basic，和pRL-TK载体，然后测荧光值
，看看你的试剂，测试程序等有没有问题。 |
B******o
发帖数: 496 | 3 你这两数据都不太正常啊。一般状况下 firefly都能几千上万，renilla也会上千（具
体数字根据transfection的ratio和量有所变化）。
同意楼上的，你最好pGL-control, basic加RL-tk做control试一试，看看测试的流程，
试剂啥的是不是有问题
【在 L**********O 的大作中提到】
: 我用promega的。
: 做triplicate，结果３值差异好大。Firefly一般background有30左右,而实验组也只有
: 30左右. Renillia一般比较正常,在１００ 左右。。
: 谢谢!~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
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z****g
发帖数: 3340 | 4 貌是这个assay variability极大，又是overexpression condition, 一般erro bar 都
超级大，不太reliable.
cell
【在 Z******5 的大作中提到】
: 你这个值也太低了吧。读数大小和荧光收集时间的设置有关，我一般设置收集2秒，自
: 己用移液枪加液（没钱，剩），每次就测3个well的。具体：
: 背景值：黑板40左右，白板100左右
: Firely的值从几万（转染效率低的细胞）到几千万（293T细胞）；Renilia的值从几百
: 到几万（我用的是pRL-TK载体做内参，转的相对较少）
: 你的明显有问题（当然前提是问题不是出在你用的promoter上），建议你在你用的cell
: line和293细胞中同时转染pGL3 control，pGL3 Basic，和pRL-TK载体，然后测荧光值
: ，看看你的试剂，测试程序等有没有问题。
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m****n
发帖数: 1066 | |
L**********O
发帖数: 1761 | 6 Thank you, guys!
I transfect the primary cells with pGL and pRL-TK at the same time using
Lipofectamine. I haven't tried transfect the 293T cells. So do you think the
first thing I need to try is to transfect the 293T cells with these two
vectors at the same time?
I think the vectors are fine, esp. the pGL--- we bought it from promega :) |
L**********O
发帖数: 1761 | 7 no. Dual Luciferase Assay
【在 m****n 的大作中提到】
: dual glo lit?
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s*********s
发帖数: 110 | 8 值太小。
每次要混匀，（细胞和transfection mix都要），否则variation很大。
【在 L**********O 的大作中提到】
: 我用promega的。
: 做triplicate，结果３值差异好大。Firefly一般background有30左右,而实验组也只有
: 30左右. Renillia一般比较正常,在１００ 左右。。
: 谢谢!~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
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W****C
发帖数: 1937 | 9 ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ 没ｗｏｒｋ。。。不行就换transfection reagent, 比如
ｆｕｌｌｇｅｎｅ |
L**********O
发帖数: 1761 | 10 do you mean Fugene?
【在 W****C 的大作中提到】
: ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ 没ｗｏｒｋ。。。不行就换transfection reagent, 比如
: ｆｕｌｌｇｅｎｅ
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m****n
发帖数: 1066 | 11 我用luminoscan ascent micro-plate reader.
用的是white wall, clear-bottom, cell culture-treated 96-well plate.
不加任何溶液的情况下，integration time 1 second or 10 second,
读数是 0.08.
这个正常吗？
Thanks。 |
B******o
发帖数: 496 | 12 你先确认一下你的primary cell能被transfect不。
其实大部分的DLA都是在293T里做的，你用primary cell有啥原因么？
the
【在 L**********O 的大作中提到】
: Thank you, guys!
: I transfect the primary cells with pGL and pRL-TK at the same time using
: Lipofectamine. I haven't tried transfect the 293T cells. So do you think the
: first thing I need to try is to transfect the 293T cells with these two
: vectors at the same time?
: I think the vectors are fine, esp. the pGL--- we bought it from promega :)
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B******o
发帖数: 496 | 13 是一般control做的好的话不会有这个问题。我们实验室一般的error bar都在10%不到
，即使是independent exps也一样
【在 z****g 的大作中提到】
: 貌是这个assay variability极大，又是overexpression condition, 一般erro bar 都
: 超级大，不太reliable.
:
: cell
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