e****p 发帖数: 354 | 1 做Northern blot, 看到清楚的目的条带,
但18S 28S位置上的有很强信号,查了PROBE并无太大同源性,PROBE 1400BP大小,用的
20ugTOTAL RNA
重复做了还是这样,有没有遇到这样的情况。有什么好办法?
多谢各位大虾 。。 |
h******u 发帖数: 131 | |
e****p 发帖数: 354 | |
h******u 发帖数: 131 | 4 一种柱子,从公司买的。如果你的基因有homologue, 或者多个isoform. 也有可能出现
这种情况。 |
n*****e 发帖数: 119 | 5 可以用kit把大部分rRNA去除。看看能不能增强信号。 |
e****p 发帖数: 354 | |
c******y 发帖数: 148 | 7 我也出现过这种情况
别人这么给我解释的,
如果你是用PCR产物做的探针,PCR的模板来自基因组的话,可能就会把一些28s 18s 基
因片段非特异扩增下来,然后被标记,而28 18RNA的量很大,所有会有信号
解决办法:
1, 使用来自质粒酶切的片段标探针
2,PCR纯化探针后,稀释1000做模板,换另一对内部引物继续PCR,纯化
3,合成oligo片段 |
w***z 发帖数: 1158 | 8 也碰到过这个问题。
用质粒做模板标记探针,针对同一基因做了2条探针,其中一条探针blot后只有特异条
带,但另一条除了特异条带外,18 28S也都有。总RNA和mRNA都试过,结果相似。 |
d******u 发帖数: 178 | 9 这个如果是直接用PCR产物标记作探针挺常见。我们是把扩增片段克隆到pGEM-T里面,
用酶切产物作探针,基本解决问题。 |
e****p 发帖数: 354 | 10 DADIAYOU 我问一下质粒酶切后还做用P32 DCTP做PCR 吧
cheerfly 割胶回收后PCR产物做探针,PCR的模板是CDNA,用OLIGODT 反转录的话,为
什么还会28 18S 污染呢?
WWWWLZ质粒做模板还是会有这种现象,你的建议是什么呢?还是探针位点问题?
非常感谢! |
d******u 发帖数: 178 | 11 质粒酶切后a-P32 CTP+Klenow标记 |
c******y 发帖数: 148 | 12 模板是cDNA,
1,cDNA合成之前是否用Dnase I 消化
2,RNA降解途径或者RNA processing过程中会出现polyA加尾现象,我了解的至少植物
叶绿体的RNA的存在这种现象,刚google下,似乎哺乳动物也存在这种异常的加尾,用
oligodT反转录有可能会产生rRNA的cDNA
3 质粒做模板
miniprep的时候是否有痕量的大肠杆菌的基因组污染?
建议放弃PCR做模板,
酶切质粒,或者合成oligo探针
1,2,3的解释也仅仅是个人猜测了
【在 e****p 的大作中提到】 : DADIAYOU 我问一下质粒酶切后还做用P32 DCTP做PCR 吧 : cheerfly 割胶回收后PCR产物做探针,PCR的模板是CDNA,用OLIGODT 反转录的话,为 : 什么还会28 18S 污染呢? : WWWWLZ质粒做模板还是会有这种现象,你的建议是什么呢?还是探针位点问题? : 非常感谢!
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e****p 发帖数: 354 | |