C*******e 发帖数: 4348 | 1 我们实验室用Thermo Scitific的Glutathione Agarose纯化GST-tag蛋白
他们的手册上说用Tris buffer
想问问看有没有人用过别的buffer
比如HEPES,phosphate,Bicine之类的?
打电话去tech support已经下班了:( |
s******y 发帖数: 28562 | 2 这个我好像一般都是用HEPES buffer
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我们实验室用Thermo Scitific的Glutathione Agarose纯化GST-tag蛋白 : 他们的手册上说用Tris buffer : 想问问看有没有人用过别的buffer : 比如HEPES,phosphate,Bicine之类的? : 打电话去tech support已经下班了:(
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C*******e 发帖数: 4348 | 3 前辈分享个方子?
lysate/binding buffer
和elute buffer
你都用同一个么?
我看说明说binding最好pH 7.4,elute pH 8.0
可是我试过
效果并不比两个都是pH 8.0好多少
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个我好像一般都是用HEPES buffer
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S*****s 发帖数: 287 | 4 我用的和你一样的 beads,试过 RIPA 和 PBS,都 work。实在不放心建议你用点样品
试一下。 |
C*******e 发帖数: 4348 | 5 谢谢!
不过这里我还是不太想用PBS buffer
因为要跟在cation exchange chromatography后面做
所以最理想的是用HEPES之类
【在 S*****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我用的和你一样的 beads,试过 RIPA 和 PBS,都 work。实在不放心建议你用点样品 : 试一下。
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s******s 发帖数: 13035 | 6 应该可以吧。GST还是比较容易纯化的,不想histag
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢! : 不过这里我还是不太想用PBS buffer : 因为要跟在cation exchange chromatography后面做 : 所以最理想的是用HEPES之类
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s******y 发帖数: 28562 | 7 我很久以前做的了,一下子还找不出来了。不过,肯定是用同一个buffer,
我好像就是直接用pH 7.5.
GST purification 的关键点是Glutathione 最好要新鲜配,其他的基本无所谓
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 前辈分享个方子? : lysate/binding buffer : 和elute buffer : 你都用同一个么? : 我看说明说binding最好pH 7.4,elute pH 8.0 : 可是我试过 : 效果并不比两个都是pH 8.0好多少
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C*******e 发帖数: 4348 | 8 HEPES 25 mM
250-300 mM NaCl
pH 7.4
你看靠谱不?
我们不用glutathione洗脱
而是用GST tag的precision protease切
所以问题不大
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我很久以前做的了,一下子还找不出来了。不过,肯定是用同一个buffer, : 我好像就是直接用pH 7.5. : GST purification 的关键点是Glutathione 最好要新鲜配,其他的基本无所谓
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s******y 发帖数: 28562 | 9 盐有点高了。这个GST tag 纯化还是很特异的,不需要那么多盐吧?
【在 C*******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : HEPES 25 mM : 250-300 mM NaCl : pH 7.4 : 你看靠谱不? : 我们不用glutathione洗脱 : 而是用GST tag的precision protease切 : 所以问题不大
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I*****y 发帖数: 6402 | 10 I, too think the salt is too high. The critical thing is adjust the pH to 8
for the reduced form of glutathione, because it's very acidic - if I
remember right.
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 盐有点高了。这个GST tag 纯化还是很特异的,不需要那么多盐吧?
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i*****g 发帖数: 11893 | 11 用Tris buffer 也可以 无关紧要,最多吸附量低一些.除非下一步做crosslink,Tris buffer 有干扰
beads 有sigma和GE healthcare两种,要买GE healthcare的那种,大概1990s 有人比
较过两种,GE吸附量可以大一倍 |
C*******e 发帖数: 4348 | 12 呃。。。。怎么说呢
我已经说了以前一直用Tris Buffer
这次不能用
因为要用阳离子交换柱,Tris有干扰
跟你说的crosslink有干扰相似又不尽然
(只有做primary amine基团的crosslinking才不能用Tris,crosslink不限于光做
primary
amine基团)
另外Glutathione Agarose不止sigma和GE两家
就像我原帖说的
我用的Thermo的(原Pierce)
Tris
buffer 有干扰
【在 i*****g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用Tris buffer 也可以 无关紧要,最多吸附量低一些.除非下一步做crosslink,Tris buffer 有干扰 : beads 有sigma和GE healthcare两种,要买GE healthcare的那种,大概1990s 有人比 : 较过两种,GE吸附量可以大一倍
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