n***w
发帖数: 2405 | 1 最近用GST beads，有个疑问，
bacteria pellet我没有用PBS dissolve，而是用了自己配的一个solution, 内含1.5%
N-lauroylsarcosine，25mM TEA和
1mM EDTA (pH 8.0)。
最近发现binding有些问题，因为ideally, binding前后的supernatant应该最明显的区
别就是target protein少了，这个我
没有观察到。
我在想到底是哪个地方出了问题。
有经验的同学指点一下～谢谢！ |
T****O
发帖数: 407 | 2 Is your pH accurate? Is your pH meter calibrated properly? |
n***w
发帖数: 2405 | 3 我这个solution没有测pH，这个也是我在想的一个问题，我要不要用PBS来配这个
buffer，然后将pH调到7.3。
我试一下明天。
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【在 n***w 的大作中提到】
: 最近用GST beads，有个疑问，
: bacteria pellet我没有用PBS dissolve，而是用了自己配的一个solution, 内含1.5%
: N-lauroylsarcosine，25mM TEA和
: 1mM EDTA (pH 8.0)。
: 最近发现binding有些问题，因为ideally, binding前后的supernatant应该最明显的区
: 别就是target protein少了，这个我
: 没有观察到。
: 我在想到底是哪个地方出了问题。
: 有经验的同学指点一下～谢谢！
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h*****b
发帖数: 492 | 4 为啥用lauroylsarcosine ? 这东西好像对珠子不好吧。ionic detergent,而且对你的
蛋白也不好啊。
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【在 n***w 的大作中提到】
: 最近用GST beads，有个疑问，
: bacteria pellet我没有用PBS dissolve，而是用了自己配的一个solution, 内含1.5%
: N-lauroylsarcosine，25mM TEA和
: 1mM EDTA (pH 8.0)。
: 最近发现binding有些问题，因为ideally, binding前后的supernatant应该最明显的区
: 别就是target protein少了，这个我
: 没有观察到。
: 我在想到底是哪个地方出了问题。
: 有经验的同学指点一下～谢谢！
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n***w
发帖数: 2405 | 5 Because most of my protein is in inclusion bodies and I don't wanna directly
go to the last resort dissolving
with guanidine hydrochloride, I found a protocol using this detergent to
increase the production of soluble
protein.
I know nothing about its physical chemical properties and I haven't thought
about the impact of this
ingredient.
Thanks.
【在 h*****b 的大作中提到】
: 为啥用lauroylsarcosine ? 这东西好像对珠子不好吧。ionic detergent,而且对你的
: 蛋白也不好啊。
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m******5
发帖数: 1383 | 6 最明显的应该是beads上蛋白拿到一大堆
蛋白产量高的话轻易就能饱和beads,很难看出来的 |
C*******e
发帖数: 4348 | 7 虽然我们也用pH 8的条件做GST蛋白纯化
但是好像pH 7.4是最佳binding
tech support的人也这么说
说buffer什么的不重要
重要的是pH
你的bead会不会饱和了？
然后我还遇到过的是除了融合蛋白以外还有27 kDa的GST-tag only表达
表达的还挺多
然后跟我的融合蛋白竞争
很容易就把柱子饱和了
哦，还有一个
你提到你的蛋白是inclusion body
我没用过N-lauroylsarcosine
如果好用的话回头汇报一下哈
不过我遇到inclusion body的时候用过Pierce的B-PerII
很好使
结果大部分都变成可溶了
当然我的那个例子比较极端
光用sonication是大多数都在pellet里
用B-PerII加sonication以后大多都在上清里
我一升的e.coli居然提了快100 ug的蛋白
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【在 n***w 的大作中提到】
: 最近用GST beads，有个疑问，
: bacteria pellet我没有用PBS dissolve，而是用了自己配的一个solution, 内含1.5%
: N-lauroylsarcosine，25mM TEA和
: 1mM EDTA (pH 8.0)。
: 最近发现binding有些问题，因为ideally, binding前后的supernatant应该最明显的区
: 别就是target protein少了，这个我
: 没有观察到。
: 我在想到底是哪个地方出了问题。
: 有经验的同学指点一下～谢谢！
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b******n
发帖数: 4225 | 8 100 ug/L的产量好像少了点，是不是蛋白有毒性或者太大？
【在 C*******e 的大作中提到】
: 虽然我们也用pH 8的条件做GST蛋白纯化
: 但是好像pH 7.4是最佳binding
: tech support的人也这么说
: 说buffer什么的不重要
: 重要的是pH
: 你的bead会不会饱和了？
: 然后我还遇到过的是除了融合蛋白以外还有27 kDa的GST-tag only表达
: 表达的还挺多
: 然后跟我的融合蛋白竞争
: 很容易就把柱子饱和了
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n***w
发帖数: 2405 | 9 嗯，有可能饱和了。
我昨天把1st binding后的supernatant又加beads了，看好没好些今天。
我觉得N-lau还是挺好使的。能solubilize大部分pellet。
我500ml的culture提了差不多160ug的蛋白。。。
我下次买点你说的B-Per试试好了～ （不过看成分也差不多）
我现在的protocol基本上是：(For 500ml culture)
1. thaw pellet on ice
2. add 18ml GST buffer (配方见上)，add 1% PI, add 2ml lysozyme (10mg/ml)，
mix on ice for 30 seconds
3. pass thru 20G syringe to reduce viscosity, also add DNAse 40ul (1mg/ml).
4. sonication (it will become clear)
5. 10000rpm, 40min，4deg
6. collect supernatant for GST beads binding
不过我这次还是将GST buffer的pH调到了7.4左右。不调的话差不多是9左右。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 虽然我们也用pH 8的条件做GST蛋白纯化
: 但是好像pH 7.4是最佳binding
: tech support的人也这么说
: 说buffer什么的不重要
: 重要的是pH
: 你的bead会不会饱和了？
: 然后我还遇到过的是除了融合蛋白以外还有27 kDa的GST-tag only表达
: 表达的还挺多
: 然后跟我的融合蛋白竞争
: 很容易就把柱子饱和了
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C*******e
发帖数: 4348 | 10 昨天晚上稀里糊涂吧单位打错了
是一升提了100 mg
【在 b******n 的大作中提到】
: 100 ug/L的产量好像少了点，是不是蛋白有毒性或者太大？
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C*******e
发帖数: 4348 | 11 记下了
谢谢！
下次要试试看。
(1mg/ml).
【在 n***w 的大作中提到】
: 嗯，有可能饱和了。
: 我昨天把1st binding后的supernatant又加beads了，看好没好些今天。
: 我觉得N-lau还是挺好使的。能solubilize大部分pellet。
: 我500ml的culture提了差不多160ug的蛋白。。。
: 我下次买点你说的B-Per试试好了～ （不过看成分也差不多）
: 我现在的protocol基本上是：(For 500ml culture)
: 1. thaw pellet on ice
: 2. add 18ml GST buffer (配方见上)，add 1% PI, add 2ml lysozyme (10mg/ml)，
: mix on ice for 30 seconds
: 3. pass thru 20G syringe to reduce viscosity, also add DNAse 40ul (1mg/ml).
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n***w
发帖数: 2405 | 12 哇。。。
还有就是我这次的GST buffer是用PBS配的，不是用水，也许有些salt的成分比较好把～
谢谢包子～
【在 C*******e 的大作中提到】
: 昨天晚上稀里糊涂吧单位打错了
: 是一升提了100 mg
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v***a
发帖数: 1242 | 13 请教一下 B-PER和Y-PER区别大吗？
我用BL21(DE3)，可以用Y-PER提吗？
【在 C*******e 的大作中提到】
: 虽然我们也用pH 8的条件做GST蛋白纯化
: 但是好像pH 7.4是最佳binding
: tech support的人也这么说
: 说buffer什么的不重要
: 重要的是pH
: 你的bead会不会饱和了？
: 然后我还遇到过的是除了融合蛋白以外还有27 kDa的GST-tag only表达
: 表达的还挺多
: 然后跟我的融合蛋白竞争
: 很容易就把柱子饱和了
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