S*********g 发帖数: 24893 | 1 我最近酶切质粒(PMD-18T)总是切的相当不好,能切开,但是切开的目的带特别弱,质
粒很亮,我guarantee质粒浓度没问题,会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了?
我用的酶是ASCI和NCOI,请高手指点,不胜感激!
PS:我在考虑可不可以加大上样量,或者在酶切体系中少加点水?
PPS:我以前博士做的是bioinfo,现在博后为了跟一个NAS的大佬,被强迫做bench
work,这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章,刚写好,压在老板手里,还没改。
我是不是应该转回bioinfo? |
k****l 发帖数: 279 | 2 目的带多长,质粒多长?
如果是100bp比10kb,那是小很多 |
p****p 发帖数: 3360 | 3 多少酶、质粒,多长时间?
最简单的解释是你的酶可能坏了。拿个别的质粒切一下看看。
改。
【在 S*********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近酶切质粒(PMD-18T)总是切的相当不好,能切开,但是切开的目的带特别弱,质 : 粒很亮,我guarantee质粒浓度没问题,会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了? : 我用的酶是ASCI和NCOI,请高手指点,不胜感激! : PS:我在考虑可不可以加大上样量,或者在酶切体系中少加点水? : PPS:我以前博士做的是bioinfo,现在博后为了跟一个NAS的大佬,被强迫做bench : work,这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章,刚写好,压在老板手里,还没改。 : 我是不是应该转回bioinfo?
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t*******o 发帖数: 424 | 4 我靠坑王转行挖学术坑了?
改。
【在 S*********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近酶切质粒(PMD-18T)总是切的相当不好,能切开,但是切开的目的带特别弱,质 : 粒很亮,我guarantee质粒浓度没问题,会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了? : 我用的酶是ASCI和NCOI,请高手指点,不胜感激! : PS:我在考虑可不可以加大上样量,或者在酶切体系中少加点水? : PPS:我以前博士做的是bioinfo,现在博后为了跟一个NAS的大佬,被强迫做bench : work,这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章,刚写好,压在老板手里,还没改。 : 我是不是应该转回bioinfo?
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n***w 发帖数: 2405 | |
s******y 发帖数: 28562 | 6 啊? 你不是已经把老板杀了么?
改。
【在 S*********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近酶切质粒(PMD-18T)总是切的相当不好,能切开,但是切开的目的带特别弱,质 : 粒很亮,我guarantee质粒浓度没问题,会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了? : 我用的酶是ASCI和NCOI,请高手指点,不胜感激! : PS:我在考虑可不可以加大上样量,或者在酶切体系中少加点水? : PPS:我以前博士做的是bioinfo,现在博后为了跟一个NAS的大佬,被强迫做bench : work,这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章,刚写好,压在老板手里,还没改。 : 我是不是应该转回bioinfo?
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c**y 发帖数: 2282 | 7 杀了也要继续做实验
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 啊? 你不是已经把老板杀了么? : : 改。
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s******y 发帖数: 28562 | 8 你的质粒的buffer 是否带有EDTA? 你用的酶是新买的么?
是的,你可以加水
改。
【在 S*********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近酶切质粒(PMD-18T)总是切的相当不好,能切开,但是切开的目的带特别弱,质 : 粒很亮,我guarantee质粒浓度没问题,会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了? : 我用的酶是ASCI和NCOI,请高手指点,不胜感激! : PS:我在考虑可不可以加大上样量,或者在酶切体系中少加点水? : PPS:我以前博士做的是bioinfo,现在博后为了跟一个NAS的大佬,被强迫做bench : work,这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章,刚写好,压在老板手里,还没改。 : 我是不是应该转回bioinfo?
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S*********g 发帖数: 24893 | 9 我试一下
谢
【在 p****p 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 多少酶、质粒,多长时间? : 最简单的解释是你的酶可能坏了。拿个别的质粒切一下看看。 : : 改。
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S*********g 发帖数: 24893 | 10 谢
【在 k****l 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 目的带多长,质粒多长? : 如果是100bp比10kb,那是小很多
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S*********g 发帖数: 24893 | 11 有EDTA
酶不是新买的,但前几天labmate也用过
没问题的
不过我还是check一下
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你的质粒的buffer 是否带有EDTA? 你用的酶是新买的么? : 是的,你可以加水 : : 改。
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s******y 发帖数: 28562 | 12 有EDTA的话就可以构成问题。
因为有些酶依赖离子,而EDTA 会chelate 那些离子。 你可以加进更多的水,
用少量的DNA, 看看怎么样。或者把DNA 重新纯化一次,然后用水溶解
【在 S*********g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有EDTA : 酶不是新买的,但前几天labmate也用过 : 没问题的 : 不过我还是check一下
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j****x 发帖数: 1704 | 13 我看你是想的太多啦,呵呵
我敢肯定,坑王如果这不是在挖坑的话,那么必然是没有考虑到片段之间长度比和亮度
之间的关系。切出来一个300bp的片段,看着比剩下来3kb的的质粒backbone亮度弱很多
倍,所以很奇怪,你说呢?
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有EDTA的话就可以构成问题。 : 因为有些酶依赖离子,而EDTA 会chelate 那些离子。 你可以加进更多的水, : 用少量的DNA, 看看怎么样。或者把DNA 重新纯化一次,然后用水溶解
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p****p 发帖数: 3360 | 14 Commercial buffers (eg, NEB) can tolerate the 1mM EDTA from TE buffer
because of much higher Mg2+ in the buffers.
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有EDTA的话就可以构成问题。 : 因为有些酶依赖离子,而EDTA 会chelate 那些离子。 你可以加进更多的水, : 用少量的DNA, 看看怎么样。或者把DNA 重新纯化一次,然后用水溶解
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h*******g 发帖数: 711 | |
s******y 发帖数: 28562 | 16 嗯,鉴于坑王不是专业生物男,是有可能出现这种错误的。
建议坑王把没有酶切的片段跑在同一个胶上看看尺寸对比。
另外一个建议就是坑王最好赶快转回生物信息,如果连这种小事都搞不定的话
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我看你是想的太多啦,呵呵 : 我敢肯定,坑王如果这不是在挖坑的话,那么必然是没有考虑到片段之间长度比和亮度 : 之间的关系。切出来一个300bp的片段,看着比剩下来3kb的的质粒backbone亮度弱很多 : 倍,所以很奇怪,你说呢?
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