S*********g
发帖数: 24893 | 1 我最近酶切质粒（PMD-18T)总是切的相当不好，能切开，但是切开的目的带特别弱，质
粒很亮，我guarantee质粒浓度没问题，会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了？
我用的酶是ASCI和NCOI，请高手指点，不胜感激！
PS：我在考虑可不可以加大上样量，或者在酶切体系中少加点水？
PPS：我以前博士做的是bioinfo，现在博后为了跟一个NAS的大佬，被强迫做bench
work，这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章，刚写好，压在老板手里，还没改。
我是不是应该转回bioinfo？ |
k****l
发帖数: 279 | 2 目的带多长，质粒多长？
如果是100bp比10kb，那是小很多 |
p****p
发帖数: 3360 | 3 多少酶、质粒，多长时间？
最简单的解释是你的酶可能坏了。拿个别的质粒切一下看看。
改。
【在 S*********g 的大作中提到】
: 我最近酶切质粒（PMD-18T)总是切的相当不好，能切开，但是切开的目的带特别弱，质
: 粒很亮，我guarantee质粒浓度没问题，会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了？
: 我用的酶是ASCI和NCOI，请高手指点，不胜感激！
: PS：我在考虑可不可以加大上样量，或者在酶切体系中少加点水？
: PPS：我以前博士做的是bioinfo，现在博后为了跟一个NAS的大佬，被强迫做bench
: work，这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章，刚写好，压在老板手里，还没改。
: 我是不是应该转回bioinfo？
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t*******o
发帖数: 424 | 4 我靠坑王转行挖学术坑了？
改。
【在 S*********g 的大作中提到】
: 我最近酶切质粒（PMD-18T)总是切的相当不好，能切开，但是切开的目的带特别弱，质
: 粒很亮，我guarantee质粒浓度没问题，会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了？
: 我用的酶是ASCI和NCOI，请高手指点，不胜感激！
: PS：我在考虑可不可以加大上样量，或者在酶切体系中少加点水？
: PPS：我以前博士做的是bioinfo，现在博后为了跟一个NAS的大佬，被强迫做bench
: work，这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章，刚写好，压在老板手里，还没改。
: 我是不是应该转回bioinfo？
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n***w
发帖数: 2405 | |
s******y
发帖数: 28562 | 6 啊？ 你不是已经把老板杀了么？
改。
【在 S*********g 的大作中提到】
: 我最近酶切质粒（PMD-18T)总是切的相当不好，能切开，但是切开的目的带特别弱，质
: 粒很亮，我guarantee质粒浓度没问题，会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了？
: 我用的酶是ASCI和NCOI，请高手指点，不胜感激！
: PS：我在考虑可不可以加大上样量，或者在酶切体系中少加点水？
: PPS：我以前博士做的是bioinfo，现在博后为了跟一个NAS的大佬，被强迫做bench
: work，这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章，刚写好，压在老板手里，还没改。
: 我是不是应该转回bioinfo？
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c**y
发帖数: 2282 | 7 杀了也要继续做实验
【在 s******y 的大作中提到】
: 啊？ 你不是已经把老板杀了么？
:
: 改。
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s******y
发帖数: 28562 | 8 你的质粒的buffer 是否带有EDTA？ 你用的酶是新买的么？
是的，你可以加水
改。
【在 S*********g 的大作中提到】
: 我最近酶切质粒（PMD-18T)总是切的相当不好，能切开，但是切开的目的带特别弱，质
: 粒很亮，我guarantee质粒浓度没问题，会不会是目的带弱质粒本身的碱基数太多了？
: 我用的酶是ASCI和NCOI，请高手指点，不胜感激！
: PS：我在考虑可不可以加大上样量，或者在酶切体系中少加点水？
: PPS：我以前博士做的是bioinfo，现在博后为了跟一个NAS的大佬，被强迫做bench
: work，这一年来非常痛苦。进展很慢。只有一篇文章，刚写好，压在老板手里，还没改。
: 我是不是应该转回bioinfo？
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S*********g
发帖数: 24893 | 9 我试一下
谢
【在 p****p 的大作中提到】
: 多少酶、质粒，多长时间？
: 最简单的解释是你的酶可能坏了。拿个别的质粒切一下看看。
:
: 改。
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S*********g
发帖数: 24893 | 10 谢
【在 k****l 的大作中提到】
: 目的带多长，质粒多长？
: 如果是100bp比10kb，那是小很多
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S*********g
发帖数: 24893 | 11 有EDTA
酶不是新买的，但前几天labmate也用过
没问题的
不过我还是check一下
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的质粒的buffer 是否带有EDTA？ 你用的酶是新买的么？
: 是的，你可以加水
:
: 改。
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s******y
发帖数: 28562 | 12 有EDTA的话就可以构成问题。
因为有些酶依赖离子，而EDTA 会chelate 那些离子。 你可以加进更多的水，
用少量的DNA, 看看怎么样。或者把DNA 重新纯化一次，然后用水溶解
【在 S*********g 的大作中提到】
: 有EDTA
: 酶不是新买的，但前几天labmate也用过
: 没问题的
: 不过我还是check一下
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j****x
发帖数: 1704 | 13 我看你是想的太多啦，呵呵
我敢肯定，坑王如果这不是在挖坑的话，那么必然是没有考虑到片段之间长度比和亮度
之间的关系。切出来一个300bp的片段，看着比剩下来3kb的的质粒backbone亮度弱很多
倍，所以很奇怪，你说呢？
【在 s******y 的大作中提到】
: 有EDTA的话就可以构成问题。
: 因为有些酶依赖离子，而EDTA 会chelate 那些离子。 你可以加进更多的水，
: 用少量的DNA, 看看怎么样。或者把DNA 重新纯化一次，然后用水溶解
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p****p
发帖数: 3360 | 14 Commercial buffers (eg, NEB) can tolerate the 1mM EDTA from TE buffer
because of much higher Mg2+ in the buffers.
【在 s******y 的大作中提到】
: 有EDTA的话就可以构成问题。
: 因为有些酶依赖离子，而EDTA 会chelate 那些离子。 你可以加进更多的水，
: 用少量的DNA, 看看怎么样。或者把DNA 重新纯化一次，然后用水溶解
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h*******g
发帖数: 711 | |
s******y
发帖数: 28562 | 16 嗯，鉴于坑王不是专业生物男，是有可能出现这种错误的。
建议坑王把没有酶切的片段跑在同一个胶上看看尺寸对比。
另外一个建议就是坑王最好赶快转回生物信息，如果连这种小事都搞不定的话
【在 j****x 的大作中提到】
: 我看你是想的太多啦，呵呵
: 我敢肯定，坑王如果这不是在挖坑的话，那么必然是没有考虑到片段之间长度比和亮度
: 之间的关系。切出来一个300bp的片段，看着比剩下来3kb的的质粒backbone亮度弱很多
: 倍，所以很奇怪，你说呢？
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