a***u
发帖数: 155 | 1 去到一个新的实验室，他们在CGH测序时发现某染色体缺失跟胰腺癌的病程有关，由此
推测此染色体上某一基因是肿瘤抑制
基因，由我接手研究此基因的功能，所采用的策略就是过表达此基因看phenotype. 我
做了大半年了，很郁闷，我试了很多种
细胞，只有一种转入该基因抑制生长。我也试了很多种方法，改变 microenviroment
看能否 push出 phenotype，但还是
没效果。我以前不是做 cancer的，我注意到文献中很多关于 tumor suppressor 都是
直接上 knock out 小鼠的，好象很少
有 overexpression来研究的。但我的二老板就是认为是我本身的原因做不出来，对我
很有意见。有做 cancer的同学能给点
建议吗？ | s******y
发帖数: 28562 | 2 我的建议是，如果某个细胞系对此基因过表达有反映，就能够作为模型，
就用那个细胞系往下接着做。就不要花时间乱试其他细胞系了。
当然还有一个关键数据就是用konockdown 的方法在其他相关细胞系里面重复。
比方本来是正常组织的对照细胞的，把那个蛋白用病毒的方法永久地knockdown, 是否能够诱导癌症生长等等。
然后等细胞数据和生化数据有眉目了再适时地时候再转上老鼠，不能一开始
就上转基因老鼠。
我不知道你的二老板水平如何，但是我从来没有听说过什么抑制癌症的基因
可以当万金油在所有的癌细胞里都能抑制的。所以我不知道他为什么要有意见。
当然，你可以装做虚心的样子，把那些你做不出来的细胞系都扔给他去做
（你能做出来的就自己留着做）。让他去碰碰钉子就老实了。
【在 a***u 的大作中提到】
: 去到一个新的实验室，他们在CGH测序时发现某染色体缺失跟胰腺癌的病程有关，由此
: 推测此染色体上某一基因是肿瘤抑制
: 基因，由我接手研究此基因的功能，所采用的策略就是过表达此基因看phenotype. 我
: 做了大半年了，很郁闷，我试了很多种
: 细胞，只有一种转入该基因抑制生长。我也试了很多种方法，改变 microenviroment
: 看能否 push出 phenotype，但还是
: 没效果。我以前不是做 cancer的，我注意到文献中很多关于 tumor suppressor 都是
: 直接上 knock out 小鼠的，好象很少
: 有 overexpression来研究的。但我的二老板就是认为是我本身的原因做不出来，对我
: 很有意见。有做 cancer的同学能给点
| f****y
发帖数: 104 | 3 所谓的tumor suppressor,主要是指gene loss of function的phenotype.
overexpression 不是确定tumor suppressor的好办法.比如,有的tumor suppressors
overexpression 就没有 phenotype.
你可以先siRNA knock down 这个基因,看看细胞增殖有没有增加,如常用的BrdU
labling之类.
此外说不定这个基因tissue specific的tumor suppressor,不一定在所有细胞系里面都
有作用.
【在 a***u 的大作中提到】
: 去到一个新的实验室，他们在CGH测序时发现某染色体缺失跟胰腺癌的病程有关，由此
: 推测此染色体上某一基因是肿瘤抑制
: 基因，由我接手研究此基因的功能，所采用的策略就是过表达此基因看phenotype. 我
: 做了大半年了，很郁闷，我试了很多种
: 细胞，只有一种转入该基因抑制生长。我也试了很多种方法，改变 microenviroment
: 看能否 push出 phenotype，但还是
: 没效果。我以前不是做 cancer的，我注意到文献中很多关于 tumor suppressor 都是
: 直接上 knock out 小鼠的，好象很少
: 有 overexpression来研究的。但我的二老板就是认为是我本身的原因做不出来，对我
: 很有意见。有做 cancer的同学能给点
| p*3
发帖数: 45 | 4 How big is your deletion region and how many genes are there in that region?
What's the rationale for suspecting your gene of interest is the critical
gene?
In other words, how sure are you that you're working on the right gene? ... | a***u
发帖数: 155 | 5 我的大老板是个醫生，歐洲人， branch chief, 對基礎研究一點也不懂，只有下班時
才會來實驗室轉轉。二老板是新招徠一年的中國人， 以前run 過兩三个人的小lab，
做老鼠的，跟腫瘤無關。
剛開始二老板對我是很欣賞，但好幾個月沒進帳感覺他很有意見，还老向大老板打小報
告，我最近才意識到，大概是說我自以為是，不聽從指揮。我不是說他水平如何，關鍵
他不是這個field 的，平時又基本不看這方面的paper，平時的精力主要放在一個大老
板喜歡的一個醫生身上。我開始的時候是每天都會跟他討論的，但他給的建議都是很老
套的一些東西，或者就是說“it could be" ""it is possible". 弄到後來我就乾脆自
己做了，懶得跟他商量。其實我在以前的實驗室很喜歡跟老板或周圍的人討論，覺得可
以得到很多靈感。這個實驗室的人大多是訪問學者性質的醫生。我覺得隔行如隔山，我
很努力地做了，但我覺得凭自己的能力沒有人指點還是很難。
二老板現在是建議我在293細胞里把這個基因敲掉，看能不能引起細胞transform。我的
直覺是不會有結果， 因為這個基因對293 細胞應該不是一個重要基因。 我不是很能說
清楚原理，只是直覺這個基因應該是tissue specific的，它跟胰腺癌細胞protein
overload 有關。當然但我還是order 了si RNA, 準備去try。
否能够诱导癌症生长等等。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我的建议是，如果某个细胞系对此基因过表达有反映，就能够作为模型，
: 就用那个细胞系往下接着做。就不要花时间乱试其他细胞系了。
: 当然还有一个关键数据就是用konockdown 的方法在其他相关细胞系里面重复。
: 比方本来是正常组织的对照细胞的，把那个蛋白用病毒的方法永久地knockdown, 是否能够诱导癌症生长等等。
: 然后等细胞数据和生化数据有眉目了再适时地时候再转上老鼠，不能一开始
: 就上转基因老鼠。
: 我不知道你的二老板水平如何，但是我从来没有听说过什么抑制癌症的基因
: 可以当万金油在所有的癌细胞里都能抑制的。所以我不知道他为什么要有意见。
: 当然，你可以装做虚心的样子，把那些你做不出来的细胞系都扔给他去做
: （你能做出来的就自己留着做）。让他去碰碰钉子就老实了。
| a***u
发帖数: 155 | 6 謝謝各位的建議。
但我們實驗室的concept 就是， 既然叫 tumor suppressor 基因， 就應該有suppress
的function, 所以就一定能做出phenotype.
這個基因當然有可能我們挑的不是一個 right 基因。 但因為整個缺失的region 只有
五個基因，只有這個基因看起來比較象。可能性還是比較大的。
我还想請教各位，如果你們實驗室發現某染色體缺失或擴增跟tumor 相關，通常是怎麼
著手去找drive gene的？ | s******y
发帖数: 28562 | 7 293 cell is already close to a cancer cell.
I am very surprised he would suggest you to knock down this gene in 293 cell
.
There is two ways to handle this:
1. try to work this out with the second boss. It is normal that he may say
something like "it's possible", "it's likely", I would say something to my
future student too, because no one wants to be arrogant. If you have
different opinion, use data or paper to shut him down and eventually leave
you alone. DON'T just stop talking to him, or he may become upset and think
you don't respect him.
2.read more review papers, not just the technical papers. SO that you can
get a sense about cancer research, and will be more ready to do your work,
or to argue with people. You also need to talk your big boss about your
progress and your concerns
3. If things really turns ugly, collect all the evidence, and ask your bi
boss to transfer you to a different project that does not lead by that
second boss.
【在 a***u 的大作中提到】
: 我的大老板是个醫生，歐洲人， branch chief, 對基礎研究一點也不懂，只有下班時
: 才會來實驗室轉轉。二老板是新招徠一年的中國人， 以前run 過兩三个人的小lab，
: 做老鼠的，跟腫瘤無關。
: 剛開始二老板對我是很欣賞，但好幾個月沒進帳感覺他很有意見，还老向大老板打小報
: 告，我最近才意識到，大概是說我自以為是，不聽從指揮。我不是說他水平如何，關鍵
: 他不是這個field 的，平時又基本不看這方面的paper，平時的精力主要放在一個大老
: 板喜歡的一個醫生身上。我開始的時候是每天都會跟他討論的，但他給的建議都是很老
: 套的一些東西，或者就是說“it could be" ""it is possible". 弄到後來我就乾脆自
: 己做了，懶得跟他商量。其實我在以前的實驗室很喜歡跟老板或周圍的人討論，覺得可
: 以得到很多靈感。這個實驗室的人大多是訪問學者性質的醫生。我覺得隔行如隔山，我
| a***u
发帖数: 155 | 8 謝謝sunnyday 的建議。
其實我已經在準備走人了。只是覺得這個project花了很大勁做成這樣，心裡不大爽，
还想再試一把，另外也覺得如果能出點東西再走不致於讓老板很生氣。
本來想來這個實驗室學點 cancer stem cell 的東西，希望以後回國能用來忽悠人。結
果比較失望。
我其實每天都在努力看很多paper, 然後跟老板們討論。悲哀的是他們根本不看paper，
並且沒有經驗， 沒辦法討論。 我以前的老板非常聰明，新老板，接觸的東西新而多，
我只要跟他一提，他馬上就明白， 我現在這個大老板，我有一次看到cell 上一篇
paper 很有啓發，很興奮地跟他們討論，大老板聽了半天，甚麼也沒明白（他連
transfection 是啥也不大明白）， 最後还發了一通脾氣說我英語不好。
我跟我以前的老板在科研思維上可能比較接近，所以總能達成共識，效率很高，以前的
几年基本一年一篇不錯的paper。但現在這個二老板的，我覺得他的建議我總是覺得很
別扭，但不做又不行，所以就不想聴他的建議了。比如說他覺得這個基因在肺癌細胞表
達也很低，肯定也應該是肺癌的tumor suppressor 基因。我按他的要求挑了一個copy
number 很低的肺癌細胞導入這個基因，但沒有任何phenotype.因為這個基因可能跟
metabolism有關，所以又試了無數的條件，如 缺氧，energy stress....等等，也沒用
，我感覺肺癌細胞是不可能有結果的，我跟二老板提出，能否回到病人 sample 看看到
底有沒有意義，因為目前database無任何數據顯示肺癌跟這個基因有關，而database別
人也得到胰腺癌跟這個基因有關的結果。二老板不同意，堅持讓我再試另一個mRNA 更
低的肺癌細胞（我已經test 過的那個在几十腫肺癌細胞中不是最低，而是倒數第三低
）我無語，心想你如果能找到一個細胞株有phenotype 又如何呢，不過我上周還是老老
實實去做了
我自己感覺，老板如果不是這個field的expert, 又不看這方面的paper，根本沒法指導
postdoc 的
cell
think
【在 s******y 的大作中提到】
: 293 cell is already close to a cancer cell.
: I am very surprised he would suggest you to knock down this gene in 293 cell
: .
: There is two ways to handle this:
: 1. try to work this out with the second boss. It is normal that he may say
: something like "it's possible", "it's likely", I would say something to my
: future student too, because no one wants to be arrogant. If you have
: different opinion, use data or paper to shut him down and eventually leave
: you alone. DON'T just stop talking to him, or he may become upset and think
: you don't respect him.
| c******r
发帖数: 3778 | 9 这个靠谱，呵呵
siRNA吧还是，简单，快速。如果不怕麻烦，想screen不同的cell lines就shRNA virus
好了。得到的cell lines将来还可以直接种老鼠上。
【在 f****y 的大作中提到】
: 所谓的tumor suppressor,主要是指gene loss of function的phenotype.
: overexpression 不是确定tumor suppressor的好办法.比如,有的tumor suppressors
: overexpression 就没有 phenotype.
: 你可以先siRNA knock down 这个基因,看看细胞增殖有没有增加,如常用的BrdU
: labling之类.
: 此外说不定这个基因tissue specific的tumor suppressor,不一定在所有细胞系里面都
: 有作用.
| C*****h
发帖数: 926 | 10 在真核生物里，overexpression很难的。很多情况是，只能增加10－20％的表达量。
【在 a***u 的大作中提到】
: 去到一个新的实验室，他们在CGH测序时发现某染色体缺失跟胰腺癌的病程有关，由此
: 推测此染色体上某一基因是肿瘤抑制
: 基因，由我接手研究此基因的功能，所采用的策略就是过表达此基因看phenotype. 我
: 做了大半年了，很郁闷，我试了很多种
: 细胞，只有一种转入该基因抑制生长。我也试了很多种方法，改变 microenviroment
: 看能否 push出 phenotype，但还是
: 没效果。我以前不是做 cancer的，我注意到文献中很多关于 tumor suppressor 都是
: 直接上 knock out 小鼠的，好象很少
: 有 overexpression来研究的。但我的二老板就是认为是我本身的原因做不出来，对我
: 很有意见。有做 cancer的同学能给点
| | | n****n
发帖数: 434 | 11 There are a couple of things you may need to know (assuming the gene is
indeed the correct TS gene):
1. A TS gene may not inhibit cell growth when overexpressed. This is because
the TS gene product may need to be activated. If your cells are not
challenged with the right condition, they may not respond to the TS. If the
TS gene product is analogous to some kinases, phosphatases, receptors, you
may be able to construct a constitutively active mutant and then use this
instead. If you suspect your TS modulate a known pathway (HIppo, TGFbeta,
etc), you should test those responses. ......
2. For making stable expression, an inducible system may be the ideal tool.
If the TS truly inhibits cell proliferation, you can imagine it is difficult
to obtain a true overexpressor. It is a growth disadvantage. The survived
clones either express low level of the gene or dont express at all.
3. Knockdown assay may not be sufficient. You probably need to knock down
the TS gene together with activation of an oncogene (Myc, Ras, etc) to see
the transformation. BTW, 293 cells are already transformed. YOu should use a
standard cell line such as NIH3T3, Rat-1 etc.
Hope this helps. | s******y
发帖数: 28562 | 12 是啊，我看到他二老板居然让他用293细胞来做KD我都惊呆了。。。
看来他二老板不但对癌症毫无概念，而且还喜欢瞎指挥。
because
the
you
.
【在 n****n 的大作中提到】
: There are a couple of things you may need to know (assuming the gene is
: indeed the correct TS gene):
: 1. A TS gene may not inhibit cell growth when overexpressed. This is because
: the TS gene product may need to be activated. If your cells are not
: challenged with the right condition, they may not respond to the TS. If the
: TS gene product is analogous to some kinases, phosphatases, receptors, you
: may be able to construct a constitutively active mutant and then use this
: instead. If you suspect your TS modulate a known pathway (HIppo, TGFbeta,
: etc), you should test those responses. ......
: 2. For making stable expression, an inducible system may be the ideal tool.
| a***u
发帖数: 155 | 13 多谢！很有启发！我想我能由此解释碰到的许多问题了。我心里基本有数该怎么做下去
了。
BTW, 如果方便的话能推荐一个 inducible 的 virus 表达载体吗？我以前用过
invitrogen 的，没成功（不表达）
because
the
you
.
【在 n****n 的大作中提到】
: There are a couple of things you may need to know (assuming the gene is
: indeed the correct TS gene):
: 1. A TS gene may not inhibit cell growth when overexpressed. This is because
: the TS gene product may need to be activated. If your cells are not
: challenged with the right condition, they may not respond to the TS. If the
: TS gene product is analogous to some kinases, phosphatases, receptors, you
: may be able to construct a constitutively active mutant and then use this
: instead. If you suspect your TS modulate a known pathway (HIppo, TGFbeta,
: etc), you should test those responses. ......
: 2. For making stable expression, an inducible system may be the ideal tool.
| h********n
发帖数: 4079 | 14 各位回帖说得真好啊. 我也乱说一些我的做法.
1. what is the promoter? if you know the promoter, you can guess whether it
is a tissue specific gene.
2. what cell type in pancreas express this gene, epithelial or other?
immuno staining should answer this question.
3. select cell lines based on answer to question 1 and 2
4. take highly malignant cancer cell lines, overexpress this gene by
transient transfection, cell viability assay, tumorigenecity (in vitro and
in vivo) assay and invasion assay should be used. Growth inhibition is not
a necessary phenotype.
5. take non-malignant cell lines, use a standard method to transform the
cell (ras, myc, other T antigen) the cell and knockdown the gene by siRNA
and/or overexpress the gene to see whether it affects growth/tumorigenecity.
6. stable expression/knockdown is tricky because of the selection process. | a***u
发帖数: 155 | 15 谢谢，我应该去弄清楚我用的几株细胞（有phenotype 和无 phenotype的）有什么不同
，还有，找一个正确的non-
malignant cell line也是很重要的
it
not
【在 h********n 的大作中提到】
: 各位回帖说得真好啊. 我也乱说一些我的做法.
: 1. what is the promoter? if you know the promoter, you can guess whether it
: is a tissue specific gene.
: 2. what cell type in pancreas express this gene, epithelial or other?
: immuno staining should answer this question.
: 3. select cell lines based on answer to question 1 and 2
: 4. take highly malignant cancer cell lines, overexpress this gene by
: transient transfection, cell viability assay, tumorigenecity (in vitro and
: in vivo) assay and invasion assay should be used. Growth inhibition is not
: a necessary phenotype.
| h********n
发帖数: 4079 | 16 HPDE6 and its subclones might be a choice.
【在 a***u 的大作中提到】
: 谢谢，我应该去弄清楚我用的几株细胞（有phenotype 和无 phenotype的）有什么不同
: ，还有，找一个正确的non-
: malignant cell line也是很重要的
:
: it
: not
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