s*********t 发帖数: 600 | 1 用420mM KCl抽提的细胞nuclear extract。
用来做IP,IP条件是盐浓度150mM。
可以直接把nuclear extract稀释到150mM KCl,蛋白浓度稀释到1ug/ul做IP吗?
还是最好先透析过夜到150mM KCl (或者还同时+ 20% sucrose浓缩)?
透析会产生好多沉淀啊,但是直接稀释却不会。
所以,这两个有什么区别?
谢谢指点。 |
s******y 发帖数: 28562 | 2 当然是稀释比较好,除非是某些需要很长时间才能交换出来的离子或者小分子。
透析的时候时间放得太长,蛋白会变性,一方面是因为你用的buffer 怎么着
也不是细胞内部的native buffer, 另外一方面,即使你用了还原剂,
也挡不住一些氧化反应,第三,extract中会有被释放出来的蛋白酶。
【在 s*********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用420mM KCl抽提的细胞nuclear extract。 : 用来做IP,IP条件是盐浓度150mM。 : 可以直接把nuclear extract稀释到150mM KCl,蛋白浓度稀释到1ug/ul做IP吗? : 还是最好先透析过夜到150mM KCl (或者还同时+ 20% sucrose浓缩)? : 透析会产生好多沉淀啊,但是直接稀释却不会。 : 所以,这两个有什么区别? : 谢谢指点。
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s*********t 发帖数: 600 | 3 这样啊。
我同时还想用nuclear extract做gel shift,周五老板建议我先透析到100mM KCl的gel
shift的binding条件,再做。我说
直接用10 ×的binding buffer稀释不行吗,我提的nuclear extract浓度比较高 (10
ug/ul),但是老板说不行。我还没
来得及问为神马,他有事就走了。
是不是做gel shift的nuclear extract透析比较好啊?
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 当然是稀释比较好,除非是某些需要很长时间才能交换出来的离子或者小分子。 : 透析的时候时间放得太长,蛋白会变性,一方面是因为你用的buffer 怎么着 : 也不是细胞内部的native buffer, 另外一方面,即使你用了还原剂, : 也挡不住一些氧化反应,第三,extract中会有被释放出来的蛋白酶。
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s*********t 发帖数: 600 | 4 还有,透析会产生沉淀啊。是不是因为盐浓度变了,一些本来溶解的蛋白又析出了。
但是直接稀释却看不到沉淀啊?这是为什么。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 当然是稀释比较好,除非是某些需要很长时间才能交换出来的离子或者小分子。 : 透析的时候时间放得太长,蛋白会变性,一方面是因为你用的buffer 怎么着 : 也不是细胞内部的native buffer, 另外一方面,即使你用了还原剂, : 也挡不住一些氧化反应,第三,extract中会有被释放出来的蛋白酶。
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s******y 发帖数: 28562 | 5 不是,其实就是在4度放久了,由于各种各样的原因变性了
【在 s*********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 还有,透析会产生沉淀啊。是不是因为盐浓度变了,一些本来溶解的蛋白又析出了。 : 但是直接稀释却看不到沉淀啊?这是为什么。
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s******y 发帖数: 28562 | 6 你老板可能觉得稀释法不如透析法彻底,方法不够好。
但是,如果透析法导致大量蛋白沉淀的话,就是更糟糕的情况。
gel
10
【在 s*********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这样啊。 : 我同时还想用nuclear extract做gel shift,周五老板建议我先透析到100mM KCl的gel : shift的binding条件,再做。我说 : 直接用10 ×的binding buffer稀释不行吗,我提的nuclear extract浓度比较高 (10 : ug/ul),但是老板说不行。我还没 : 来得及问为神马,他有事就走了。 : 是不是做gel shift的nuclear extract透析比较好啊?
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s*********t 发帖数: 600 | 7 是这样吗?
可是我觉得我放进预冷的4度透析buffer一两个小时之后就看到混浊了。而放在冰上那
么久,也不会有混浊啊。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 不是,其实就是在4度放久了,由于各种各样的原因变性了
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s*********t 发帖数: 600 | 8 是啊,看到那么多沉淀我好担心。
我打算把nuclear extract分成两份,一份透析了再用,另一部分直接稀释用。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你老板可能觉得稀释法不如透析法彻底,方法不够好。 : 但是,如果透析法导致大量蛋白沉淀的话,就是更糟糕的情况。 : : gel : 10
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s******y 发帖数: 28562 | 9 你说的那个盐析应该也是原因之一
【在 s*********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 是这样吗? : 可是我觉得我放进预冷的4度透析buffer一两个小时之后就看到混浊了。而放在冰上那 : 么久,也不会有混浊啊。
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s*********t 发帖数: 600 | 10 我还加了20% sucrose在透析buffer,是不是这样更好?
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你老板可能觉得稀释法不如透析法彻底,方法不够好。 : 但是,如果透析法导致大量蛋白沉淀的话,就是更糟糕的情况。 : : gel : 10
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s******y 发帖数: 28562 | 11 这个说不上好还是不好。
这种添加剂,就是视蛋白而定,好就是好,不好就是不好,
没有太多规律可言(主要是要弄清楚太麻烦,一般都是靠经验)
【在 s*********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我还加了20% sucrose在透析buffer,是不是这样更好?
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o**4 发帖数: 35028 | 12 不是吧,
我的蛋白搁在4°,没见过沉淀啊?
倒是透析每次都会有沉淀
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 不是,其实就是在4度放久了,由于各种各样的原因变性了
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s******y 发帖数: 28562 | 13 哎,大家怎么这么喜欢较真啊。我说的那个4度变性是指那个总蛋白的抽提物。
里面有各种各样的蛋白酶什么的,在4度里面,你再加什么抑制剂也挡不了
它们慢慢起作用,再加上氧化反应。。。
而纯化后的蛋白一般都没有那些杂七杂八的东西,而且都是保存在适合的
缓冲液里面的,而且是在密封的管子里的。当然不会那么容易变性。
但是假如把一个细胞总蛋白随便的放在某个不三不四的缓冲液里面,
然后把盖子掀开透气,4度放过夜之后应该会沉淀了吧?
当然,透析的时候,总会有一些蛋白因为盐析的原因,或者和透析膜有各种接触,
而沉淀的。不过这个具体到底是什么原因我似乎没有看见有人去分析过。
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 不是吧, : 我的蛋白搁在4°,没见过沉淀啊? : 倒是透析每次都会有沉淀
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D******9 发帖数: 2665 | 14 我以前用过MILLIPORE的离心柱子浓缩了蛋白, 然后稀释的,用来做GEL SHIFT,倒是
WORK的 |