s*********t
发帖数: 600 | 1 用420mM KCl抽提的细胞nuclear extract。
用来做IP，IP条件是盐浓度150mM。
可以直接把nuclear extract稀释到150mM KCl，蛋白浓度稀释到1ug／ul做IP吗？
还是最好先透析过夜到150mM KCl (或者还同时+ 20% sucrose浓缩)？
透析会产生好多沉淀啊，但是直接稀释却不会。
所以，这两个有什么区别？
谢谢指点。 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 当然是稀释比较好，除非是某些需要很长时间才能交换出来的离子或者小分子。
透析的时候时间放得太长，蛋白会变性，一方面是因为你用的buffer 怎么着
也不是细胞内部的native buffer, 另外一方面，即使你用了还原剂，
也挡不住一些氧化反应，第三，extract中会有被释放出来的蛋白酶。
【在 s*********t 的大作中提到】
: 用420mM KCl抽提的细胞nuclear extract。
: 用来做IP，IP条件是盐浓度150mM。
: 可以直接把nuclear extract稀释到150mM KCl，蛋白浓度稀释到1ug／ul做IP吗？
: 还是最好先透析过夜到150mM KCl (或者还同时+ 20% sucrose浓缩)？
: 透析会产生好多沉淀啊，但是直接稀释却不会。
: 所以，这两个有什么区别？
: 谢谢指点。
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s*********t
发帖数: 600 | 3 这样啊。
我同时还想用nuclear extract做gel shift，周五老板建议我先透析到100mM KCl的gel
shift的binding条件，再做。我说
直接用10 ×的binding buffer稀释不行吗，我提的nuclear extract浓度比较高 （10
ug／ul），但是老板说不行。我还没
来得及问为神马，他有事就走了。
是不是做gel shift的nuclear extract透析比较好啊？
【在 s******y 的大作中提到】
: 当然是稀释比较好，除非是某些需要很长时间才能交换出来的离子或者小分子。
: 透析的时候时间放得太长，蛋白会变性，一方面是因为你用的buffer 怎么着
: 也不是细胞内部的native buffer, 另外一方面，即使你用了还原剂，
: 也挡不住一些氧化反应，第三，extract中会有被释放出来的蛋白酶。
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s*********t
发帖数: 600 | 4 还有，透析会产生沉淀啊。是不是因为盐浓度变了，一些本来溶解的蛋白又析出了。
但是直接稀释却看不到沉淀啊？这是为什么。
【在 s******y 的大作中提到】
: 当然是稀释比较好，除非是某些需要很长时间才能交换出来的离子或者小分子。
: 透析的时候时间放得太长，蛋白会变性，一方面是因为你用的buffer 怎么着
: 也不是细胞内部的native buffer, 另外一方面，即使你用了还原剂，
: 也挡不住一些氧化反应，第三，extract中会有被释放出来的蛋白酶。
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s******y
发帖数: 28562 | 5 不是，其实就是在4度放久了，由于各种各样的原因变性了
【在 s*********t 的大作中提到】
: 还有，透析会产生沉淀啊。是不是因为盐浓度变了，一些本来溶解的蛋白又析出了。
: 但是直接稀释却看不到沉淀啊？这是为什么。
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s******y
发帖数: 28562 | 6 你老板可能觉得稀释法不如透析法彻底，方法不够好。
但是，如果透析法导致大量蛋白沉淀的话，就是更糟糕的情况。
gel
10
【在 s*********t 的大作中提到】
: 这样啊。
: 我同时还想用nuclear extract做gel shift，周五老板建议我先透析到100mM KCl的gel
: shift的binding条件，再做。我说
: 直接用10 ×的binding buffer稀释不行吗，我提的nuclear extract浓度比较高 （10
: ug／ul），但是老板说不行。我还没
: 来得及问为神马，他有事就走了。
: 是不是做gel shift的nuclear extract透析比较好啊？
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s*********t
发帖数: 600 | 7 是这样吗？
可是我觉得我放进预冷的4度透析buffer一两个小时之后就看到混浊了。而放在冰上那
么久，也不会有混浊啊。
【在 s******y 的大作中提到】
: 不是，其实就是在4度放久了，由于各种各样的原因变性了
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s*********t
发帖数: 600 | 8 是啊，看到那么多沉淀我好担心。
我打算把nuclear extract分成两份，一份透析了再用，另一部分直接稀释用。
【在 s******y 的大作中提到】
: 你老板可能觉得稀释法不如透析法彻底，方法不够好。
: 但是，如果透析法导致大量蛋白沉淀的话，就是更糟糕的情况。
:
: gel
: 10
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s******y
发帖数: 28562 | 9 你说的那个盐析应该也是原因之一
【在 s*********t 的大作中提到】
: 是这样吗？
: 可是我觉得我放进预冷的4度透析buffer一两个小时之后就看到混浊了。而放在冰上那
: 么久，也不会有混浊啊。
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s*********t
发帖数: 600 | 10 我还加了20％ sucrose在透析buffer，是不是这样更好？
【在 s******y 的大作中提到】
: 你老板可能觉得稀释法不如透析法彻底，方法不够好。
: 但是，如果透析法导致大量蛋白沉淀的话，就是更糟糕的情况。
:
: gel
: 10
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s******y
发帖数: 28562 | 11 这个说不上好还是不好。
这种添加剂，就是视蛋白而定，好就是好，不好就是不好，
没有太多规律可言（主要是要弄清楚太麻烦，一般都是靠经验）
【在 s*********t 的大作中提到】
: 我还加了20％ sucrose在透析buffer，是不是这样更好？
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o**4
发帖数: 35028 | 12 不是吧，
我的蛋白搁在4°，没见过沉淀啊？
倒是透析每次都会有沉淀
【在 s******y 的大作中提到】
: 不是，其实就是在4度放久了，由于各种各样的原因变性了
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s******y
发帖数: 28562 | 13 哎，大家怎么这么喜欢较真啊。我说的那个4度变性是指那个总蛋白的抽提物。
里面有各种各样的蛋白酶什么的，在4度里面，你再加什么抑制剂也挡不了
它们慢慢起作用，再加上氧化反应。。。
而纯化后的蛋白一般都没有那些杂七杂八的东西，而且都是保存在适合的
缓冲液里面的，而且是在密封的管子里的。当然不会那么容易变性。
但是假如把一个细胞总蛋白随便的放在某个不三不四的缓冲液里面，
然后把盖子掀开透气，4度放过夜之后应该会沉淀了吧？
当然，透析的时候，总会有一些蛋白因为盐析的原因，或者和透析膜有各种接触，
而沉淀的。不过这个具体到底是什么原因我似乎没有看见有人去分析过。
【在 o**4 的大作中提到】
: 不是吧，
: 我的蛋白搁在4°，没见过沉淀啊？
: 倒是透析每次都会有沉淀
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D******9
发帖数: 2665 | 14 我以前用过MILLIPORE的离心柱子浓缩了蛋白， 然后稀释的，用来做GEL SHIFT,倒是
WORK的 |
