s*****t
发帖数: 107 | |
m******5
发帖数: 1383 | 2 google N-chip和X-chip
两种不同的方法
用酶digest的非特异性binding少，并且因为去掉了cross linking的步骤，能用的抗体
数大大增加。缺点是很难拿到transcriptional factor和特定片断的binding 。做
Histon的人应该用得多些，但因为没有cross linking，也会引入很多非特异性的
nucleosome remodeling。
用sonication 以及cross linking配合的方法好处是拿到的相互作用理论上说更接近生
理条件，但因为引入了固定这个过程，也导致许多artificial 作用， 比如蛋白质，
DNA间非功能性的相互作用 |
s******u
发帖数: 81 | 3 麻烦展开说说为啥N-ChIP会丢掉特定片段的binding?
【在 m******5 的大作中提到】
: google N-chip和X-chip
: 两种不同的方法
: 用酶digest的非特异性binding少，并且因为去掉了cross linking的步骤，能用的抗体
: 数大大增加。缺点是很难拿到transcriptional factor和特定片断的binding 。做
: Histon的人应该用得多些，但因为没有cross linking，也会引入很多非特异性的
: nucleosome remodeling。
: 用sonication 以及cross linking配合的方法好处是拿到的相互作用理论上说更接近生
: 理条件，但因为引入了固定这个过程，也导致许多artificial 作用， 比如蛋白质，
: DNA间非功能性的相互作用
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m******5
发帖数: 1383 | 4 因为没有cross linking啊，很多binding在buffer条件下就挂了。 类似的比如做一些
比较弱的相互作用的co-ip， 要摸很多buffer条件，optimize到一个合适的stringency
【在 s******u 的大作中提到】
: 麻烦展开说说为啥N-ChIP会丢掉特定片段的binding?
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s******s
发帖数: 13035 | 5 MNase也可以先crosslink，甚至可以有人crosslink->MNase->sonicate
repressive marker貌似sonicate很难做好，用MNase能做的很漂亮
【在 m******5 的大作中提到】
: google N-chip和X-chip
: 两种不同的方法
: 用酶digest的非特异性binding少，并且因为去掉了cross linking的步骤，能用的抗体
: 数大大增加。缺点是很难拿到transcriptional factor和特定片断的binding 。做
: Histon的人应该用得多些，但因为没有cross linking，也会引入很多非特异性的
: nucleosome remodeling。
: 用sonication 以及cross linking配合的方法好处是拿到的相互作用理论上说更接近生
: 理条件，但因为引入了固定这个过程，也导致许多artificial 作用， 比如蛋白质，
: DNA间非功能性的相互作用
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m******5
发帖数: 1383 | 6 有比较有代表性的protocol么？我最近正折腾这个
【在 s******s 的大作中提到】
: MNase也可以先crosslink，甚至可以有人crosslink->MNase->sonicate
: repressive marker貌似sonicate很难做好，用MNase能做的很漂亮
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a****o
发帖数: 1786 | 7 It is very cell line dependent.
MNase has very strong sequence bias.
【在 s******s 的大作中提到】
: MNase也可以先crosslink，甚至可以有人crosslink->MNase->sonicate
: repressive marker貌似sonicate很难做好，用MNase能做的很漂亮
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d****7
发帖数: 109 | 8 看你要做啥，一般都是sonication，但是如果你想要nuclesome级别的resolution，可
以用MNase，不过用MNase比较tricky，现在一般人都是用一定浓度的MNase处理一段时
间，然后开始做实验，而Mark Ptashne lab发现MNase有很强的sequence bias，他们组
用浓度梯度的MNase处理，你可以瞅一瞅，另外，可以看看这篇评论：http://www.cell.com/current-biology/abstract/S0960-9822%2811%2900116-3
【在 s*****t 的大作中提到】
: 请大家发个言
: /
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s******u
发帖数: 81 | 9 多谢！
另外的原因可能还有digestion enzyme的sequence preference.
说到co-IP, lysis buffer一般都加detergent吗？看别人的文章基本都加，可有的
interaction加了detergent几乎检测不到。
stringency
【在 m******5 的大作中提到】
: 因为没有cross linking啊，很多binding在buffer条件下就挂了。 类似的比如做一些
: 比较弱的相互作用的co-ip， 要摸很多buffer条件，optimize到一个合适的stringency
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a****o
发帖数: 1786 | 10 MNase有很强的sequence bias, 大家已经知道快30年了，只是最近才被大家认真对待
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC326882/
比较sonication和MNase
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2964211/?tool=pubme
MNase浓度对结果的影响
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19846608
【在 d****7 的大作中提到】
: 看你要做啥，一般都是sonication，但是如果你想要nuclesome级别的resolution，可
: 以用MNase，不过用MNase比较tricky，现在一般人都是用一定浓度的MNase处理一段时
: 间，然后开始做实验，而Mark Ptashne lab发现MNase有很强的sequence bias，他们组
: 用浓度梯度的MNase处理，你可以瞅一瞅，另外，可以看看这篇评论：http://www.cell.com/current-biology/abstract/S0960-9822%2811%2900116-3
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