D*a
发帖数: 6830 | 1 菜鸟问，到底这个东东能用在哪些方面？搜了一下，不得要领。
比如我们认为有证据证明病人很可能在某个gene上有mutation(氨基酸突变，deletion
，whatever)，是不是适用这个？或者什么其他方法？不是测肿瘤的突变，是全身
genome的突变。
求科普下最基本的什么题目适用NGS。
有review一类paper介绍用处也好，我下了看看。
thanks! |
c*******d
发帖数: 192 | |
G***y
发帖数: 1082 | 3 Take a look at the Nature Review Genetics Review series:
Applications of next-generation sequencing
http://www.nature.com/nrg/series/nextgeneration/index.html
deletion
【在 D*a 的大作中提到】
: 菜鸟问，到底这个东东能用在哪些方面？搜了一下，不得要领。
: 比如我们认为有证据证明病人很可能在某个gene上有mutation(氨基酸突变，deletion
: ，whatever)，是不是适用这个？或者什么其他方法？不是测肿瘤的突变，是全身
: genome的突变。
: 求科普下最基本的什么题目适用NGS。
: 有review一类paper介绍用处也好，我下了看看。
: thanks!
|
s******s
发帖数: 13035 | 4 某个基因，是你知道的某个基因还是你不知道？
你知道的化只要普通seq就行了，你不知道可以next-gen，但是很耗钱，除非病人有钱
deletion
【在 D*a 的大作中提到】
: 菜鸟问，到底这个东东能用在哪些方面？搜了一下，不得要领。
: 比如我们认为有证据证明病人很可能在某个gene上有mutation(氨基酸突变，deletion
: ，whatever)，是不是适用这个？或者什么其他方法？不是测肿瘤的突变，是全身
: genome的突变。
: 求科普下最基本的什么题目适用NGS。
: 有review一类paper介绍用处也好，我下了看看。
: thanks!
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D******9
发帖数: 2665 | 5 现在不是说whole genome sequencing 只要5000刀了吗？ |
s******s
发帖数: 13035 | 6 如果你能忍受这个的错误率和覆盖率
【在 D******9 的大作中提到】
: 现在不是说whole genome sequencing 只要5000刀了吗？
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G***y
发帖数: 1082 | 7 Complete Genomics is offering good-quality data for 5K, 4K for bigger
batches.
【在 s******s 的大作中提到】
: 如果你能忍受这个的错误率和覆盖率
|
D*a
发帖数: 6830 | 8 是知道的基因，有想法。但是一个基因也很长吧？现在有几个病人要测。病人能活肯定
是heterozygote，再加上一些正常的polymorphism，一般测序不会有问题么？我刚测了
四只老鼠的1000bp的一段序列，觉得很多碱基都不清楚都需要自己再回过头来看，如果
整个基因加上两边一点疑似调控序列都测的话，挨个做pcr再测序再自己拼基因是不是
太费时间了呀？
如果普通seq测下来这个基因要是没有突变怎么办，NGS的话我们可以综合考虑一下。不
知道我这个想法可行不可行。
我们现在想评估一下这个测下来的时间和花费，如果真要做工资成本也要考虑进去，因
为如果普通测序自己拼图我肯定会推掉的。如果NGS我倒是想学一下。到时候出paper随
便吧，我要是有时间就弄个草稿，要是没有时间我共同一作放后边也无所谓。
【在 s******s 的大作中提到】
: 某个基因，是你知道的某个基因还是你不知道？
: 你知道的化只要普通seq就行了，你不知道可以next-gen，但是很耗钱，除非病人有钱
:
: deletion
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D*a
发帖数: 6830 | |
D*a
发帖数: 6830 | 10 多谢！很全啊
【在 G***y 的大作中提到】
: Take a look at the Nature Review Genetics Review series:
: Applications of next-generation sequencing
: http://www.nature.com/nrg/series/nextgeneration/index.html
:
: deletion
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s******s
发帖数: 13035 | 11 我觉得NGS你没这么多钱全测, 只能targeted, 用probe pull down或者PCR,
价格也不低或者工作量也不小, 还不如手工测. 如果只测exon/tss啥的,也就是
几个plate而已.
【在 D*a 的大作中提到】
: 是知道的基因，有想法。但是一个基因也很长吧？现在有几个病人要测。病人能活肯定
: 是heterozygote，再加上一些正常的polymorphism，一般测序不会有问题么？我刚测了
: 四只老鼠的1000bp的一段序列，觉得很多碱基都不清楚都需要自己再回过头来看，如果
: 整个基因加上两边一点疑似调控序列都测的话，挨个做pcr再测序再自己拼基因是不是
: 太费时间了呀？
: 如果普通seq测下来这个基因要是没有突变怎么办，NGS的话我们可以综合考虑一下。不
: 知道我这个想法可行不可行。
: 我们现在想评估一下这个测下来的时间和花费，如果真要做工资成本也要考虑进去，因
: 为如果普通测序自己拼图我肯定会推掉的。如果NGS我倒是想学一下。到时候出paper随
: 便吧，我要是有时间就弄个草稿，要是没有时间我共同一作放后边也无所谓。
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D*a
发帖数: 6830 | 12 我们也是想targeted，现在有目标基因，不想搞gwas那种。我们打算连intron和promotor都测啊。
我今天下午找了几篇测rna的给老板看，我老板还说，我不想只测rna啊。晕。
关键是我们不是测病人的实验室，所以很多东西都要从头弄。他现在想的是让一个人跟
他弄出project来，该学的东西学了，需要帮忙就看看能不能弄钱来招个tech之类的。
如果要手工测，我肯定是不干，我没有动力去揽这个活呀，呵呵。再说我也没有空。
【在 s******s 的大作中提到】
: 我觉得NGS你没这么多钱全测, 只能targeted, 用probe pull down或者PCR,
: 价格也不低或者工作量也不小, 还不如手工测. 如果只测exon/tss啥的,也就是
: 几个plate而已.
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s******s
发帖数: 13035 | 13 先弄钱吧。有了钱，我觉得最简单的就是让agilent做probe，找个
公司或者合作实验室NGS，你统筹一下就行了，最省力
promotor都测啊。
【在 D*a 的大作中提到】
: 我们也是想targeted，现在有目标基因，不想搞gwas那种。我们打算连intron和promotor都测啊。
: 我今天下午找了几篇测rna的给老板看，我老板还说，我不想只测rna啊。晕。
: 关键是我们不是测病人的实验室，所以很多东西都要从头弄。他现在想的是让一个人跟
: 他弄出project来，该学的东西学了，需要帮忙就看看能不能弄钱来招个tech之类的。
: 如果要手工测，我肯定是不干，我没有动力去揽这个活呀，呵呵。再说我也没有空。
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o********r
发帖数: 775 | 14 NGS只是一个平台，很难回答你到底能做啥事，主要取决于你的实验设计
FDA is planning a one-day public meeting on June 23rd, 2011, to discuss
potential approaches and questions around assessing analytical validity of
whole genome sequencing platforms for clinical applications, focusing on NGS
and newer/upcoming platforms. Meeting will be held in Silver Spring, MD (
FDA campus). There will be a free webcast during the meeting and it will be
accessible through the archives after the meeting. You are invited to
register for the meeting or the webcast.
http://www.fda.gov/MedicalDevices/NewsEvents/WorkshopsConferenc
deletion
这个直接screening the gene就是，不用NGS。NGS可以用来筛选哪些基因需要下一步
screening
deletion |
D*a
发帖数: 6830 | 15 是呀 有了钱啥都好说。关键是我不大懂这个，上来问问可行性。我如果只测一两个基
因，从design probe到拿到
序列大概要多久啊？
【在 s******s 的大作中提到】
: 先弄钱吧。有了钱，我觉得最简单的就是让agilent做probe，找个
: 公司或者合作实验室NGS，你统筹一下就行了，最省力
:
: promotor都测啊。
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s******s
发帖数: 13035 | 16 看你自己做还是有专家做了。我没做过，估计最短一个月，最长不知道
【在 D*a 的大作中提到】
: 是呀 有了钱啥都好说。关键是我不大懂这个，上来问问可行性。我如果只测一两个基
: 因，从design probe到拿到
: 序列大概要多久啊？
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D*a
发帖数: 6830 | 17 多谢！ 这个会看上去很有意思，就算不用听听应该很好玩。
我其实也不懂到底哪种适合干什么，我自己是想借这个机会学学NGS的。 你说NGS主要
是找基因，那找到之后还
必须要全长重新用sanger法再从头到尾测一遍么？还是能缩小到比较小的一段？
NGS
be
【在 o********r 的大作中提到】
: NGS只是一个平台，很难回答你到底能做啥事，主要取决于你的实验设计
: FDA is planning a one-day public meeting on June 23rd, 2011, to discuss
: potential approaches and questions around assessing analytical validity of
: whole genome sequencing platforms for clinical applications, focusing on NGS
: and newer/upcoming platforms. Meeting will be held in Silver Spring, MD (
: FDA campus). There will be a free webcast during the meeting and it will be
: accessible through the archives after the meeting. You are invited to
: register for the meeting or the webcast.
: http://www.fda.gov/MedicalDevices/NewsEvents/WorkshopsConferenc
: deletion
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o********r
发帖数: 775 | 18 NGS用来提供leads（哪些基因需要进入下一步），下一步是对candidate genes在其他
独立samples中sanger测序确认（测recurrence）。你可以只测一个点，也可以全基因
测序（取决于你准备花多少钱）。据说现在第二步也有illumina的alternative，费用
是sanger的一半左右。
【在 D*a 的大作中提到】
: 多谢！ 这个会看上去很有意思，就算不用听听应该很好玩。
: 我其实也不懂到底哪种适合干什么，我自己是想借这个机会学学NGS的。 你说NGS主要
: 是找基因，那找到之后还
: 必须要全长重新用sanger法再从头到尾测一遍么？还是能缩小到比较小的一段？
:
: NGS
: be
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m*********n
发帖数: 215 | 19 其实whole genome sequencing的specificity如果和exonme sequencing相比的话是非
常接近的。
【在 s******s 的大作中提到】
: 如果你能忍受这个的错误率和覆盖率
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m*********n
发帖数: 215 | 20 如果你要detect de nova mutation的话，可以用whole genome sequencing。其实平均
到每个base pair，whole genome sequencing比exonme sequencing便宜，而且可以
detect在3'utr, 5‘utr和non-coding sequencing上的信号。 |
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w*****t
发帖数: 49 | 21 钱主要有3方面：
sample prepare,
run,
post-run analysis.
大家谈钱总是说run要多少钱，
实际上通常sample prepare，和post run analysis更花钱。
sample的获取，mrna的纯化，library的built，都是大把大把的money。
post-run analysis你看看research biostatistician的工资就明白了。
你要是啥都自己弄我就不说啥了，
但是你要是想publish top journal，
你没有biostatistician backup是没戏的。
promotor都测啊。
【在 D*a 的大作中提到】
: 我们也是想targeted，现在有目标基因，不想搞gwas那种。我们打算连intron和promotor都测啊。
: 我今天下午找了几篇测rna的给老板看，我老板还说，我不想只测rna啊。晕。
: 关键是我们不是测病人的实验室，所以很多东西都要从头弄。他现在想的是让一个人跟
: 他弄出project来，该学的东西学了，需要帮忙就看看能不能弄钱来招个tech之类的。
: 如果要手工测，我肯定是不干，我没有动力去揽这个活呀，呵呵。再说我也没有空。
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s******s
发帖数: 13035 | 22 人家不是要exon seq, lz都知道要测那个具体基因了。
【在 m*********n 的大作中提到】
: 其实whole genome sequencing的specificity如果和exonme sequencing相比的话是非
: 常接近的。
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s******s
发帖数: 13035 | 23 //nod. 这样说吧，analysis找个合作的就行了，挂个作者不花钱，
其实对方也不耗什么精力。一个library加上run大概$2k+? 自己做
是不现实的。多个sample可以multiplex，但是library和kit收费
会更多。自己做PCR成本大概$1k, 想用方便的probe enrich至少$10k.
所以自己做PCR，自己测序，大概$2k就能搞定
自己PCR， 找人用next-seq，大概$10k以内，而且其实更费时间
用enrich, 找人next-seq, 最方便，大概要$20k
【在 w*****t 的大作中提到】
: 钱主要有3方面：
: sample prepare,
: run,
: post-run analysis.
: 大家谈钱总是说run要多少钱，
: 实际上通常sample prepare，和post run analysis更花钱。
: sample的获取，mrna的纯化，library的built，都是大把大把的money。
: post-run analysis你看看research biostatistician的工资就明白了。
: 你要是啥都自己弄我就不说啥了，
: 但是你要是想publish top journal，
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o********r
发帖数: 775 | 24 你想得美，analysis找个合作的挂名作者就不花钱？这个合作者真是大好人。。。俺们
这边没戏，你除了花钱，还得让出一个二作/倒数第二（如果不是并列一作/并列通讯作
者）的位置才有谈合作的基础。当然如果大牛实验室另说，不过这种实验室一般不会盘
算这种几万刀的成本问题，速度才是他们考虑的问题
【在 s******s 的大作中提到】
: //nod. 这样说吧，analysis找个合作的就行了，挂个作者不花钱，
: 其实对方也不耗什么精力。一个library加上run大概$2k+? 自己做
: 是不现实的。多个sample可以multiplex，但是library和kit收费
: 会更多。自己做PCR成本大概$1k, 想用方便的probe enrich至少$10k.
: 所以自己做PCR，自己测序，大概$2k就能搞定
: 自己PCR， 找人用next-seq，大概$10k以内，而且其实更费时间
: 用enrich, 找人next-seq, 最方便，大概要$20k
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w******e
发帖数: 1187 | 25 偶们所有的next-gen seq，都是合作者付钱，合作者帮忙事先处理sample＋事后分析结
果，
我们要啥data，比如XX round和XX round比对选出top 1000 sequence，都是人家搞好了
把excel发过来。。。不知道还能爽多久呵呵
【在 o********r 的大作中提到】
: 你想得美，analysis找个合作的挂名作者就不花钱？这个合作者真是大好人。。。俺们
: 这边没戏，你除了花钱，还得让出一个二作/倒数第二（如果不是并列一作/并列通讯作
: 者）的位置才有谈合作的基础。当然如果大牛实验室另说，不过这种实验室一般不会盘
: 算这种几万刀的成本问题，速度才是他们考虑的问题
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y******8
发帖数: 1764 | 26 How many rounds would you prefer for your selection?
好了
【在 w******e 的大作中提到】
: 偶们所有的next-gen seq，都是合作者付钱，合作者帮忙事先处理sample＋事后分析结
: 果，
: 我们要啥data，比如XX round和XX round比对选出top 1000 sequence，都是人家搞好了
: 把excel发过来。。。不知道还能爽多久呵呵
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w******e
发帖数: 1187 | 27 directed evolution:
http://www.nature.com/nbt/journal/v28/n9/full/nbt.1673.html
http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.p
deletion
【在 D*a 的大作中提到】
: 菜鸟问，到底这个东东能用在哪些方面？搜了一下，不得要领。
: 比如我们认为有证据证明病人很可能在某个gene上有mutation(氨基酸突变，deletion
: ，whatever)，是不是适用这个？或者什么其他方法？不是测肿瘤的突变，是全身
: genome的突变。
: 求科普下最基本的什么题目适用NGS。
: 有review一类paper介绍用处也好，我下了看看。
: thanks!
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w******e
发帖数: 1187 | 28 it highly depends on target
【在 y******8 的大作中提到】
: How many rounds would you prefer for your selection?
:
: 好了
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y******8
发帖数: 1764 | 29 Are 2 or 3 rounds enough?
I am thinking of doing some pilot tests. If more than 10 rounds, I probably
have to give up.
【在 w******e 的大作中提到】
: it highly depends on target
|
w******e
发帖数: 1187 | 30 I can only speak for SELEX, which is hard to achieve in 2 or 3 rounds using
conventional methods.
probably
【在 y******8 的大作中提到】
: Are 2 or 3 rounds enough?
: I am thinking of doing some pilot tests. If more than 10 rounds, I probably
: have to give up.
|
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y******8
发帖数: 1764 | 31 Thanks.
I thought using Illumina HiSeq, two rounds would be enough
to give me candidates.
using
【在 w******e 的大作中提到】
: I can only speak for SELEX, which is hard to achieve in 2 or 3 rounds using
: conventional methods.
:
: probably
|
w******e
发帖数: 1187 | 32 well, if you design it in a smart way you might get sth from
1 round (as shown in the 2 papers I cited above). it's just
not that easy w/o hands-on expertise
【在 y******8 的大作中提到】
: Thanks.
: I thought using Illumina HiSeq, two rounds would be enough
: to give me candidates.
:
: using
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D*a
发帖数: 6830 | 33 我们确实是想同时关注3'utr, 5‘utr和non-coding sequencing上的信号的，不仅仅测
exon。我能不能限制几个target genes来做？会更省钱更快么？
【在 m*********n 的大作中提到】
: 如果你要detect de nova mutation的话，可以用whole genome sequencing。其实平均
: 到每个base pair，whole genome sequencing比exonme sequencing便宜，而且可以
: detect在3'utr, 5‘utr和non-coding sequencing上的信号。
|
y******8
发帖数: 1764 | 34 如果需要测序的区段大于20k，样品数量大于20个，可以考虑NGS，否则还是传统测序或
者用array吧。
【在 m*********n 的大作中提到】
: 如果你要detect de nova mutation的话，可以用whole genome sequencing。其实平均
: 到每个base pair，whole genome sequencing比exonme sequencing便宜，而且可以
: detect在3'utr, 5‘utr和non-coding sequencing上的信号。
|
s******s
发帖数: 13035 | 35 我前面说过了，target要么你做PCR，要么用probe，大概$10k+.
target慢的多了，好处是coverage高
【在 D*a 的大作中提到】
: 我们确实是想同时关注3'utr, 5‘utr和non-coding sequencing上的信号的，不仅仅测
: exon。我能不能限制几个target genes来做？会更省钱更快么？
|
D*a
发帖数: 6830 | 36 能不能稍微说下怎么叫用probe？有没有paper啥的
纯菜鸟...
【在 s******s 的大作中提到】
: 我前面说过了，target要么你做PCR，要么用probe，大概$10k+.
: target慢的多了，好处是coverage高
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y******8
发帖数: 1764 | 37 各大公司把自己microarray上的probe改良后用来杂交富集样品DNA中的targets。如果
targets的总大小在100k，最好500k以上才比较合适。100k以下还是PCR吧。
【在 D*a 的大作中提到】
: 能不能稍微说下怎么叫用probe？有没有paper啥的
: 纯菜鸟...
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s******s
发帖数: 13035 | 38 恩。其实我早就说过，他的case自己PCR测序最方便，一定要搞又慢又贵又fancy的
【在 y******8 的大作中提到】
: 各大公司把自己microarray上的probe改良后用来杂交富集样品DNA中的targets。如果
: targets的总大小在100k，最好500k以上才比较合适。100k以下还是PCR吧。
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D*a
发帖数: 6830 | 39 哈哈，我也不懂呀。
【在 s******s 的大作中提到】
: 恩。其实我早就说过，他的case自己PCR测序最方便，一定要搞又慢又贵又fancy的
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D*a
发帖数: 6830 | |
