o**4 发帖数: 35028 | 1 我的protein有250KD,
准备建细胞系,用western筛选,为什么western blot没有任何positive clone呢?
我用的是电转,
问题是在overexpression,还是在western呢?
O(∩_∩)O谢谢 |
s*********t 发帖数: 600 | 2 1 先做个瞬转,看看你的质粒是否表达。
2 250kD的蛋白做western很容易。6%的gel,转膜buffer加SDS和15%乙醇。膜用PVDF
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s*****v 发帖数: 274 | |
h*******o 发帖数: 4884 | 4 10%-30% 都可以
我记得PVDF膜,甲醇浓度高有利于transfer效率
但是nitrocellulose 膜就不一样
【在 s*****v 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 15% 乙醇 靠谱么?? : 纯好奇。
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i****f 发帖数: 979 | 5
PVDF
请问你说的6%是resolving gel吧,那stacking gel要多少浓度啊?我们的胶都是自己
制。另外,我也在做大概190kD的 western,请问该多少浓度啊?
谢谢
【在 s*********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 1 先做个瞬转,看看你的质粒是否表达。 : 2 250kD的蛋白做western很容易。6%的gel,转膜buffer加SDS和15%乙醇。膜用PVDF : 。
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S******e 发帖数: 393 | 6 我常做200kD以上的western, 用6%的胶,
做transient transfection 试试看。
当然有一蛋白做瞬转检测不到表达,但stable cell line却筛选到了。 |
o**4 发帖数: 35028 | 7 请问,你用的湿转么?
transfer buffer用的是什么配方啊?
【在 S******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我常做200kD以上的western, 用6%的胶, : 做transient transfection 试试看。 : 当然有一蛋白做瞬转检测不到表达,但stable cell line却筛选到了。
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c*z 发帖数: 157 | 8 15%MeOH, I guess
I have worked with CBP, a 250k protein
I used iBlot dry transfer, nitrocellular membrane
But the trick is:
1, soak the gel in buffer for 10min before transfer
2, expand the transfer time to 10min (not 7 min)
the bands were very sharp and dark
semi-dry transfer did not work good
【在 s*****v 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 15% 乙醇 靠谱么?? : 纯好奇。
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S******e 发帖数: 393 | 9 传统方法,1 X transfer buffer: 30mM Tris, 240mM Glycine, 20% methanol,
另外可加可不加SDS(0.2%)。
我一般40伏过夜,nitrocellulose membrane。
另外,也不一定是western问题,首先还是要确定你的基因/蛋白是不是表达了,
做个瞬转吧,250kD 不太难,我做过这么大蛋白瞬转的,做western也检测到了表达。
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 请问,你用的湿转么? : transfer buffer用的是什么配方啊?
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f********n 发帖数: 6465 | 10 你都可以指导楼主了?厉害。
PVDF
【在 s*********t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 1 先做个瞬转,看看你的质粒是否表达。 : 2 250kD的蛋白做western很容易。6%的gel,转膜buffer加SDS和15%乙醇。膜用PVDF : 。
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s******s 发帖数: 13035 | 11 我有个变态蛋白是加SDS, 100V过夜或者300v x 4hr
【在 S******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 传统方法,1 X transfer buffer: 30mM Tris, 240mM Glycine, 20% methanol, : 另外可加可不加SDS(0.2%)。 : 我一般40伏过夜,nitrocellulose membrane。 : 另外,也不一定是western问题,首先还是要确定你的基因/蛋白是不是表达了, : 做个瞬转吧,250kD 不太难,我做过这么大蛋白瞬转的,做western也检测到了表达。
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s*********t 发帖数: 600 | 12 是乙醇不是甲醇。本来是用甲醇,但是不是有毒么,所以最好用乙醇替代,效果是完全
一样的。
我们实验室一直用乙醇
【在 s*****v 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 15% 乙醇 靠谱么?? : 纯好奇。
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o**4 发帖数: 35028 | 13 PVDF膜用同样的方法可以么?
我昨天用你这个buffer with 0.1% SDS,过夜之后,连marker都全失踪了。
【在 S******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 传统方法,1 X transfer buffer: 30mM Tris, 240mM Glycine, 20% methanol, : 另外可加可不加SDS(0.2%)。 : 我一般40伏过夜,nitrocellulose membrane。 : 另外,也不一定是western问题,首先还是要确定你的基因/蛋白是不是表达了, : 做个瞬转吧,250kD 不太难,我做过这么大蛋白瞬转的,做western也检测到了表达。
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S******e 发帖数: 393 | 14 你确信电源没搞反? 我一直用这个方法转的,好几年了。
我用的NC膜,PVDF膜应该没问题。
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : PVDF膜用同样的方法可以么? : 我昨天用你这个buffer with 0.1% SDS,过夜之后,连marker都全失踪了。
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o**4 发帖数: 35028 | 15 肯定没搞反啊,是不是过夜转太猛所以不行了?
但是我的methonal浓度是10%
【在 S******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你确信电源没搞反? 我一直用这个方法转的,好几年了。 : 我用的NC膜,PVDF膜应该没问题。
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S******e 发帖数: 393 | 16 过夜没问题,我经常过夜转,10% methanol 也没问题。
搞不明白你哪里有问题,想问一下你做其他western有问题吗?
克隆我筛过几次,尤其较大蛋白,很容易得到nagtive clone,
有一个200多kD蛋白,我印象中筛了几十个克隆才得到一两个postive的,
另外一种情况,一个蛋白过量表达也可能会使细胞致死,这种情况下,
你得到的clone可能全是假的或截短的。 |
o**4 发帖数: 35028 | 17 我做其他western 从来就没出现过这种问题啊,都是过夜转,这次过夜转居然连marker
都不见了,你过夜转用的什么条件,我用的是40V过夜。
【在 S******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 过夜没问题,我经常过夜转,10% methanol 也没问题。 : 搞不明白你哪里有问题,想问一下你做其他western有问题吗? : 克隆我筛过几次,尤其较大蛋白,很容易得到nagtive clone, : 有一个200多kD蛋白,我印象中筛了几十个克隆才得到一两个postive的, : 另外一种情况,一个蛋白过量表达也可能会使细胞致死,这种情况下, : 你得到的clone可能全是假的或截短的。
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S******e 发帖数: 393 | 18 40V没问题。
marker 没了,很奇怪, 可能哪里有失误。
marker
【在 o**4 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我做其他western 从来就没出现过这种问题啊,都是过夜转,这次过夜转居然连marker : 都不见了,你过夜转用的什么条件,我用的是40V过夜。
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o**4 发帖数: 35028 | 19 晕啊
【在 S******e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 40V没问题。 : marker 没了,很奇怪, 可能哪里有失误。 : : marker
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