o**4
发帖数: 35028 | 1 我的protein有250KD，
准备建细胞系，用western筛选，为什么western blot没有任何positive clone呢？
我用的是电转，
问题是在overexpression，还是在western呢？
O(∩_∩)O谢谢 |
s*********t
发帖数: 600 | 2 1 先做个瞬转，看看你的质粒是否表达。
2 250kD的蛋白做western很容易。6％的gel，转膜buffer加SDS和15％乙醇。膜用PVDF
。 |
s*****v
发帖数: 274 | |
h*******o
发帖数: 4884 | 4 10%-30% 都可以
我记得PVDF膜,甲醇浓度高有利于transfer效率
但是nitrocellulose 膜就不一样
【在 s*****v 的大作中提到】
: 15% 乙醇 靠谱么？？
: 纯好奇。
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i****f
发帖数: 979 | 5
PVDF
请问你说的6%是resolving gel吧，那stacking gel要多少浓度啊？我们的胶都是自己
制。另外，我也在做大概190kD的 western，请问该多少浓度啊？
谢谢
【在 s*********t 的大作中提到】
: 1 先做个瞬转，看看你的质粒是否表达。
: 2 250kD的蛋白做western很容易。6％的gel，转膜buffer加SDS和15％乙醇。膜用PVDF
: 。
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S******e
发帖数: 393 | 6 我常做200kD以上的western, 用6%的胶，
做transient transfection 试试看。
当然有一蛋白做瞬转检测不到表达，但stable cell line却筛选到了。 |
o**4
发帖数: 35028 | 7 请问，你用的湿转么？
transfer buffer用的是什么配方啊？
【在 S******e 的大作中提到】
: 我常做200kD以上的western, 用6%的胶，
: 做transient transfection 试试看。
: 当然有一蛋白做瞬转检测不到表达，但stable cell line却筛选到了。
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c*z
发帖数: 157 | 8 15%MeOH, I guess
I have worked with CBP, a 250k protein
I used iBlot dry transfer, nitrocellular membrane
But the trick is:
1, soak the gel in buffer for 10min before transfer
2, expand the transfer time to 10min (not 7 min)
the bands were very sharp and dark
semi-dry transfer did not work good
【在 s*****v 的大作中提到】
: 15% 乙醇 靠谱么？？
: 纯好奇。
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S******e
发帖数: 393 | 9 传统方法，1 X transfer buffer: 30mM Tris, 240mM Glycine, 20% methanol，
另外可加可不加SDS(0.2%)。
我一般40伏过夜，nitrocellulose membrane。
另外，也不一定是western问题，首先还是要确定你的基因/蛋白是不是表达了，
做个瞬转吧，250kD 不太难，我做过这么大蛋白瞬转的，做western也检测到了表达。
【在 o**4 的大作中提到】
: 请问，你用的湿转么？
: transfer buffer用的是什么配方啊？
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f********n
发帖数: 6465 | 10 你都可以指导楼主了？厉害。
PVDF
【在 s*********t 的大作中提到】
: 1 先做个瞬转，看看你的质粒是否表达。
: 2 250kD的蛋白做western很容易。6％的gel，转膜buffer加SDS和15％乙醇。膜用PVDF
: 。
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s******s
发帖数: 13035 | 11 我有个变态蛋白是加SDS, 100V过夜或者300v x 4hr
【在 S******e 的大作中提到】
: 传统方法，1 X transfer buffer: 30mM Tris, 240mM Glycine, 20% methanol，
: 另外可加可不加SDS(0.2%)。
: 我一般40伏过夜，nitrocellulose membrane。
: 另外，也不一定是western问题，首先还是要确定你的基因/蛋白是不是表达了，
: 做个瞬转吧，250kD 不太难，我做过这么大蛋白瞬转的，做western也检测到了表达。
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s*********t
发帖数: 600 | 12 是乙醇不是甲醇。本来是用甲醇，但是不是有毒么，所以最好用乙醇替代，效果是完全
一样的。
我们实验室一直用乙醇
【在 s*****v 的大作中提到】
: 15% 乙醇 靠谱么？？
: 纯好奇。
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o**4
发帖数: 35028 | 13 PVDF膜用同样的方法可以么？
我昨天用你这个buffer with 0.1% SDS，过夜之后，连marker都全失踪了。
【在 S******e 的大作中提到】
: 传统方法，1 X transfer buffer: 30mM Tris, 240mM Glycine, 20% methanol，
: 另外可加可不加SDS(0.2%)。
: 我一般40伏过夜，nitrocellulose membrane。
: 另外，也不一定是western问题，首先还是要确定你的基因/蛋白是不是表达了，
: 做个瞬转吧，250kD 不太难，我做过这么大蛋白瞬转的，做western也检测到了表达。
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S******e
发帖数: 393 | 14 你确信电源没搞反？ 我一直用这个方法转的，好几年了。
我用的NC膜，PVDF膜应该没问题。
【在 o**4 的大作中提到】
: PVDF膜用同样的方法可以么？
: 我昨天用你这个buffer with 0.1% SDS，过夜之后，连marker都全失踪了。
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o**4
发帖数: 35028 | 15 肯定没搞反啊，是不是过夜转太猛所以不行了？
但是我的methonal浓度是10%
【在 S******e 的大作中提到】
: 你确信电源没搞反？ 我一直用这个方法转的，好几年了。
: 我用的NC膜，PVDF膜应该没问题。
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S******e
发帖数: 393 | 16 过夜没问题，我经常过夜转，10% methanol 也没问题。
搞不明白你哪里有问题，想问一下你做其他western有问题吗？
克隆我筛过几次，尤其较大蛋白，很容易得到nagtive clone,
有一个200多kD蛋白，我印象中筛了几十个克隆才得到一两个postive的，
另外一种情况，一个蛋白过量表达也可能会使细胞致死，这种情况下，
你得到的clone可能全是假的或截短的。 |
o**4
发帖数: 35028 | 17 我做其他western 从来就没出现过这种问题啊，都是过夜转，这次过夜转居然连marker
都不见了，你过夜转用的什么条件，我用的是40V过夜。
【在 S******e 的大作中提到】
: 过夜没问题，我经常过夜转，10% methanol 也没问题。
: 搞不明白你哪里有问题，想问一下你做其他western有问题吗？
: 克隆我筛过几次，尤其较大蛋白，很容易得到nagtive clone,
: 有一个200多kD蛋白，我印象中筛了几十个克隆才得到一两个postive的，
: 另外一种情况，一个蛋白过量表达也可能会使细胞致死，这种情况下，
: 你得到的clone可能全是假的或截短的。
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S******e
发帖数: 393 | 18 40V没问题。
marker 没了，很奇怪， 可能哪里有失误。
marker
【在 o**4 的大作中提到】
: 我做其他western 从来就没出现过这种问题啊，都是过夜转，这次过夜转居然连marker
: 都不见了，你过夜转用的什么条件，我用的是40V过夜。
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o**4
发帖数: 35028 | 19 晕啊
【在 S******e 的大作中提到】
: 40V没问题。
: marker 没了，很奇怪， 可能哪里有失误。
:
: marker
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