d****i
发帖数: 2346 | 1 我们从老鼠分离出来细胞，裂解细胞后酚氯仿抽提DNA，沉淀后溶于20uL水。随后用
QIAGEN的kit进行convert和纯化，用Tis洗脱后做模板进行PCR扩增，产物用来做
pyrsequencing检测甲基化程度。
问题：PCR的时候条带很淡，有的sample扩增不出来。可能的原因是什么？
第一批sample模板用量6uL的时候扩增不出来，减少到2uL可以，条带很明显。
第二批sample用同样的办法，摸索了不同的模板量都不能成功。
谢谢！ |
s******s
发帖数: 13035 | 2 首先引物设计对么？
模板要多用，要加DMSO,酶要好酶（Hifi Taq一类，最好加taq extender)，pcr
温度要低。当然这都做到了，有些还是批不出来，你最好多设计点引物，至少
有个阳性对照吧？
【在 d****i 的大作中提到】
: 我们从老鼠分离出来细胞，裂解细胞后酚氯仿抽提DNA，沉淀后溶于20uL水。随后用
: QIAGEN的kit进行convert和纯化，用Tis洗脱后做模板进行PCR扩增，产物用来做
: pyrsequencing检测甲基化程度。
: 问题：PCR的时候条带很淡，有的sample扩增不出来。可能的原因是什么？
: 第一批sample模板用量6uL的时候扩增不出来，减少到2uL可以，条带很明显。
: 第二批sample用同样的办法，摸索了不同的模板量都不能成功。
: 谢谢！
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m******5
发帖数: 1383 | 3 恩，用高特异性长引物配合GC buffer低退火温度+好酶
基本就不用摸条件了，由短到长战无不胜 |
d****i
发帖数: 2346 | 4 2批sample唯一的区别是sample不一样(但是treatment很类似)，其余的都一样。所以，
不可能是引物和PCR温度的问题。 |
j****x
发帖数: 1704 | |
s******s
发帖数: 13035 | 6 没有啥肯定的。好P的东西怎么P都能做出来，不好P的东西同样条件，
稍微有点微小扰动就可能P出来。
【在 d****i 的大作中提到】
: 2批sample唯一的区别是sample不一样(但是treatment很类似)，其余的都一样。所以，
: 不可能是引物和PCR温度的问题。
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d****i
发帖数: 2346 | 7 为了得率高一些，sample很珍贵。
【在 j****x 的大作中提到】
: 为什么用酚氯仿抽提DNA？这个纯度不太好吧
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d****i
发帖数: 2346 | 8 大家都用哪个kit抽提DNA？
那个kit进行convert？我们现在用的是QIAGEN的，但是那个bisulfite mix每次都不能
彻底的溶解，tube下面总有一点颗粒的东西不能完全溶解，放60半小时也不行。 |
s******s
发帖数: 13035 | 9 为啥这个得率高？苯酚这种东西抽不干净很麻烦的
【在 d****i 的大作中提到】
: 为了得率高一些，sample很珍贵。
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m*****y
发帖数: 857 | 10 google "nested PCR"
【在 d****i 的大作中提到】
: 我们从老鼠分离出来细胞，裂解细胞后酚氯仿抽提DNA，沉淀后溶于20uL水。随后用
: QIAGEN的kit进行convert和纯化，用Tis洗脱后做模板进行PCR扩增，产物用来做
: pyrsequencing检测甲基化程度。
: 问题：PCR的时候条带很淡，有的sample扩增不出来。可能的原因是什么？
: 第一批sample模板用量6uL的时候扩增不出来，减少到2uL可以，条带很明显。
: 第二批sample用同样的办法，摸索了不同的模板量都不能成功。
: 谢谢！
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d****i
发帖数: 2346 | 11 谢谢！nested PCR我知道，我去看看用这个有没有办法改善。
【在 m*****y 的大作中提到】
: google "nested PCR"
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