W**S 发帖数: 275 | 1 今天悲摧了,generate了一批LENTIVIRUS,结果PURO SELECT之后CELL都死了,这次着
急,没做MIDI PREP,直接用MINIPREP的PLASMID做的TRANSFECTION, PLASMID的质量不
是太好,浓度很低,260/230不太好,同一批用MIDIPREP GENERATE的VIRUS没问题。请
问LENTIVIRUS不WORK会是因为PLASMID的质量不好吗?以前也用MINIPREP的PLASMID做过
,没问题。多谢! |
s******s 发帖数: 13035 | 2 yes. 要用质量很好的plasmid
【在 W**S 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 今天悲摧了,generate了一批LENTIVIRUS,结果PURO SELECT之后CELL都死了,这次着 : 急,没做MIDI PREP,直接用MINIPREP的PLASMID做的TRANSFECTION, PLASMID的质量不 : 是太好,浓度很低,260/230不太好,同一批用MIDIPREP GENERATE的VIRUS没问题。请 : 问LENTIVIRUS不WORK会是因为PLASMID的质量不好吗?以前也用MINIPREP的PLASMID做过 : ,没问题。多谢!
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C*****h 发帖数: 926 | 3 titer会低一两个数量级,但是不会是零。
你的问题是,根本没有virus,所以,应该是别的原因。
【在 W**S 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 今天悲摧了,generate了一批LENTIVIRUS,结果PURO SELECT之后CELL都死了,这次着 : 急,没做MIDI PREP,直接用MINIPREP的PLASMID做的TRANSFECTION, PLASMID的质量不 : 是太好,浓度很低,260/230不太好,同一批用MIDIPREP GENERATE的VIRUS没问题。请 : 问LENTIVIRUS不WORK会是因为PLASMID的质量不好吗?以前也用MINIPREP的PLASMID做过 : ,没问题。多谢!
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W**S 发帖数: 275 | 4 多谢!看来要做个MIDIPREP,这次MINIPREP的完全不WORK,CELL死光光了。
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : yes. 要用质量很好的plasmid
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j****x 发帖数: 1704 | 5 质粒浓度很低,纯度很差的话,差出N个数量级一点不奇怪,如果内毒素再高一点,不
出毒也很正常
【在 C*****h 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : titer会低一两个数量级,但是不会是零。 : 你的问题是,根本没有virus,所以,应该是别的原因。
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C*****h 发帖数: 926 | 6 miniprep的DNA质量,再怎么也不会太差。
我的经验是,我用miniprep做的virus,比midiprep的要高。
我现在一直就是用miniprep的DNA,做virus,没有出现过问题。
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 质粒浓度很低,纯度很差的话,差出N个数量级一点不奇怪,如果内毒素再高一点,不 : 出毒也很正常
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W**S 发帖数: 275 | 7 我也是奇怪在这呢,就算TITER低也不至于一点没有。PLASMID用RE DIGESTION CHECK了
,有INSERT, 是PLKO-TET-ON LENTIVIRUS SHRNA construct, 用STBL2转的,不至于丢
了PURO啊。
【在 C*****h 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : titer会低一两个数量级,但是不会是零。 : 你的问题是,根本没有virus,所以,应该是别的原因。
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W**S 发帖数: 275 | 8 我以前也用MINIPREP,没问题。这辈子做LENTIVIRUS都没出过问题,今天不知道咋了。
对了,LAB MANAGER图便宜,最近ORDER的是NECLEOBOND的MINIPREP KIT,以前都用
QIAGEN的,这次用这个KIT提完,感觉ELUTE不像TE的感觉,像有DETERGENT是的,一弹
有很多BUBBLE,后来问LAB人,他们用这KIT都做OPTIONAL的AW BUFFER WASH,我没做。
不知道是不是这个原因。
【在 C*****h 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : miniprep的DNA质量,再怎么也不会太差。 : 我的经验是,我用miniprep做的virus,比midiprep的要高。 : 我现在一直就是用miniprep的DNA,做virus,没有出现过问题。
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j****x 发帖数: 1704 | 9 这个难说,mini的KIT质量是良莠不齐,我曾经用过一个之后连GFP转染都有问题的。
按LZ的说法,抽提的质粒浓度低质量差的话,本身就说明不正常。
【在 C*****h 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : miniprep的DNA质量,再怎么也不会太差。 : 我的经验是,我用miniprep做的virus,比midiprep的要高。 : 我现在一直就是用miniprep的DNA,做virus,没有出现过问题。
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C*****h 发帖数: 926 | 10 把elute下来的DNA,用酒精沉淀一下就行了。
【在 W**S 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我以前也用MINIPREP,没问题。这辈子做LENTIVIRUS都没出过问题,今天不知道咋了。 : 对了,LAB MANAGER图便宜,最近ORDER的是NECLEOBOND的MINIPREP KIT,以前都用 : QIAGEN的,这次用这个KIT提完,感觉ELUTE不像TE的感觉,像有DETERGENT是的,一弹 : 有很多BUBBLE,后来问LAB人,他们用这KIT都做OPTIONAL的AW BUFFER WASH,我没做。 : 不知道是不是这个原因。
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s******s 发帖数: 13035 | 11 我们实验室的标准是,midi或者maxi,如果用mini, 必须是qiacube做出来的
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个难说,mini的KIT质量是良莠不齐,我曾经用过一个之后连GFP转染都有问题的。 : 按LZ的说法,抽提的质粒浓度低质量差的话,本身就说明不正常。
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