a*******u
发帖数: 19 | 1 N-terminal fragment C-terminal fragment
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方案1：
引物设计如下
PrimerN_For: A$$$$$$$$$$$$$$
PrimerN_Rev: B**********
PrimerC_For: B&&&&&&&&&&&
PrimerC_Rev: C@@@@@@@@
A,B,C分别表示 不同的内切酶。
用分别将两端PCR下来依次插入到载体中，即N端以空载体为载体插入，然后将C端以N端
插入完毕的质粒做载体插入。这样的问题是多了一个B的内切酶序列，多2个aminos。
deletion mutants允许多2个外源的aminos吗？
方案2：
引物设计如下：
PrimerN_For: A$$$$$$$$$$$$$$
PrimerN_Rev: &&&&**********
PrimerC_For: &&&&&&&&&&&
PrimerC_Rev: C@@@@@@@@
A,C分别表示不同的内切酶。&&&&**********表示&&&&为C端的一部分序列，**********为N端
的一部分序列。
分别PCR并胶回收N端和C端，然后将N端和C端混在一起做模板，以
PrimerN_For:A$$$$$$$$$$$$$$ 和PrimerC_Rev: C@@@@@@@@ 为引物做PCR，直
接PCR出来N端和C端的连接体。
因为我的蛋白有5个domain，我要缺失中间3个domain，则有deletion1-2-3，deletion1
-2，deletion1-3，deletin2-3，deletion1，deletion2，deletion3，这么多
deletion。同时只有N端和C端以及中间的产物都要，也就是要整个1套缺失体和单独的domain的
质粒。
方案1的缺点是deletion mutant多了2个aminos，但是我要缺失多个domain，获得的更多的质
粒。
方案2的缺点是只能获得缺失体，其他的还得单独克隆。
请教各位，我要获得缺失体是不是只能按方案2走，不能带2个外源的aminos？
引物设计是否能改进；或者有更好的构建缺失体的方法？ |
s****u
发帖数: 483 | 2 i guess u should use overlapping PCR to make life easier. |
y*******4
发帖数: 487 | 3
【在 s****u 的大作中提到】
: i guess u should use overlapping PCR to make life easier.
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a*******u
发帖数: 19 | 4 如果我用6个碱基的内切酶序列替代300多的domain构建deletion mutant，这样的
deletion mutant用来做mapping以及功能实验 会不会被人质疑？
【在 s****u 的大作中提到】
: i guess u should use overlapping PCR to make life easier.
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s****u
发帖数: 483 | 5 strictly yes
【在 a*******u 的大作中提到】
: 如果我用6个碱基的内切酶序列替代300多的domain构建deletion mutant，这样的
: deletion mutant用来做mapping以及功能实验 会不会被人质疑？
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