b**********8 发帖数: 349 | 1 我想了解一段启动子序列甲基化和非甲基化对基因转录的影响(已经证实经某处理
因素处理后该段DNA序列甲基化频率显著降低),已经成功构建了包含该段序列的荧光
素酶报告基因(PGL3 basic vector),该如何继续下游实验?看到相关的paper,有的是
直接把质粒用 MSss I在体外甲基化修饰后纯化回收后进行转染,比如这两篇文章http://cancerres.aacrjournals.org/content/66/9/4566.full.pdf
http://cancerres.aacrjournals.org/content/61/11/4628.full.pdf
有的则是把特定的启动子序列切下来进行体外的MSss I甲基化修饰,然后重新连接
回原来的vector,把连接液纯化后直接转染,比如这篇paper,http://mcb.asm.org/cgi/reprint/26/22/8572.pdf。
个人觉得第二种方法更严谨。第一种方法虽然简单,但是整个质粒上负责luciferase最
终表达的元件很多,他们的甲基化可能会对实验结果形成干扰。第二种方法似乎更为合
理,但是我觉得有几个问题,首先。质粒连接产物纯化回收过程中是不是特别容易断裂
啊?第二,连接产物中应该还有不少自连克隆吧,这也会对实验有影响的吧?第三,连
接产物转染的时候如何定量?直接把纯化后的产物测OD260和 OD280?
请大家对以上两种方法进行评价,另外,请问还有没有其他思路和方法完成我这个实验
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b**********8 发帖数: 349 | |
s******s 发帖数: 13035 | 3 第一种太糙了,估计其他抗性啥的都不表达了。
你为什么不去问paper的author
【在 b**********8 的大作中提到】 : up
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d****i 发帖数: 2346 | 4 我们用的就是第一种方法,蛮好的,我没觉得有什么问题。因为就算是这个plasmid的
所有sequence都被methylated了也无所谓,转到细胞内以后只关心我的promoter和
luciferase的转录表达,其余backbone上的序列不要也无所谓,有没有转录表达没关系
。再说你肯定要做一个control。
第二种方法看上去确实是更严谨,但是我个人认为和luciferase转录表达有关的,来自
plasmid的只有promoter和后面的polyA了,不一定对啊。
如果你实在不放心可以去要这个质粒:(pCpGl-basic)。backbone上都是修饰过的没有
潜在methylation位点的。整个plasmid拿来做in vitro methylation对backbone没有影
响。
http://www.ag-rehli.de/materials.htm#pCpGL |
b**********8 发帖数: 349 | 5 体外甲基化修饰后的质粒是直接用来转染细胞的,不用做转化和质粒抽提,应该不用考
虑抗性丢失的问题了吧? Anyway, thanks a lot!
【在 s******s 的大作中提到】 : 第一种太糙了,估计其他抗性啥的都不表达了。 : 你为什么不去问paper的author
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b**********8 发帖数: 349 | 6 多谢回复,你提供的信息对我实在太有用了,thanks a lot
【在 d****i 的大作中提到】 : 我们用的就是第一种方法,蛮好的,我没觉得有什么问题。因为就算是这个plasmid的 : 所有sequence都被methylated了也无所谓,转到细胞内以后只关心我的promoter和 : luciferase的转录表达,其余backbone上的序列不要也无所谓,有没有转录表达没关系 : 。再说你肯定要做一个control。 : 第二种方法看上去确实是更严谨,但是我个人认为和luciferase转录表达有关的,来自 : plasmid的只有promoter和后面的polyA了,不一定对啊。 : 如果你实在不放心可以去要这个质粒:(pCpGl-basic)。backbone上都是修饰过的没有 : 潜在methylation位点的。整个plasmid拿来做in vitro methylation对backbone没有影 : 响。 : http://www.ag-rehli.de/materials.htm#pCpGL
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