g*o
发帖数: 769 | 1 最近连续两次, 300mA, 1.5hr, 只有少量的marker转到膜上
上次: 用自己4C冷藏的reused transfer buffer, 以前precut的硝酸纤维素膜.
这次: 用了新配的transfer buffer, 新切的硝酸纤维素膜, 换了转膜的chamber. 相同
电源条件: 300mA, 1.5hr. 结果类似, 还是只有一点点转到膜上, 胶上还有不少蓝
marker. 再用邻座小胖的reused transfer buffer, 加转1hr, 几乎没有看到任何
improvement.
胶貌似没问题. 我分别做的7.5%, 9%, 12%的胶, marker泳动速度和胶浓度一致, 清清
楚楚分开了.
简单的转膜会出什么问题呢? 盒子换过了, buffer换过了, 胶新配的且跑的没见问题,
膜是公用and新切的...连滤纸也是以前precut好的, 一直没问题, 现在都差不多用完
了....做western近10年, 忽然遇到这样的怪事, 哪位达人能帮忙分析解释一下? | s******s
发帖数: 13035 | 2 no idea. 300mA 4hr试试？
题,
【在 g*o 的大作中提到】
: 最近连续两次, 300mA, 1.5hr, 只有少量的marker转到膜上
: 上次: 用自己4C冷藏的reused transfer buffer, 以前precut的硝酸纤维素膜.
: 这次: 用了新配的transfer buffer, 新切的硝酸纤维素膜, 换了转膜的chamber. 相同
: 电源条件: 300mA, 1.5hr. 结果类似, 还是只有一点点转到膜上, 胶上还有不少蓝
: marker. 再用邻座小胖的reused transfer buffer, 加转1hr, 几乎没有看到任何
: improvement.
: 胶貌似没问题. 我分别做的7.5%, 9%, 12%的胶, marker泳动速度和胶浓度一致, 清清
: 楚楚分开了.
: 简单的转膜会出什么问题呢? 盒子换过了, buffer换过了, 胶新配的且跑的没见问题,
: 膜是公用and新切的...连滤纸也是以前precut好的, 一直没问题, 现在都差不多用完
| m*****u
发帖数: 15526 | 3 肯定是条件的问题。要么transfer buffer配错了。要不就是电源接触有问题
题,
【在 g*o 的大作中提到】
: 最近连续两次, 300mA, 1.5hr, 只有少量的marker转到膜上
: 上次: 用自己4C冷藏的reused transfer buffer, 以前precut的硝酸纤维素膜.
: 这次: 用了新配的transfer buffer, 新切的硝酸纤维素膜, 换了转膜的chamber. 相同
: 电源条件: 300mA, 1.5hr. 结果类似, 还是只有一点点转到膜上, 胶上还有不少蓝
: marker. 再用邻座小胖的reused transfer buffer, 加转1hr, 几乎没有看到任何
: improvement.
: 胶貌似没问题. 我分别做的7.5%, 9%, 12%的胶, marker泳动速度和胶浓度一致, 清清
: 楚楚分开了.
: 简单的转膜会出什么问题呢? 盒子换过了, buffer换过了, 胶新配的且跑的没见问题,
: 膜是公用and新切的...连滤纸也是以前precut好的, 一直没问题, 现在都差不多用完
| C*****h
发帖数: 926 | 4 可能是电源坏了。换一个电源。
题,
【在 g*o 的大作中提到】
: 最近连续两次, 300mA, 1.5hr, 只有少量的marker转到膜上
: 上次: 用自己4C冷藏的reused transfer buffer, 以前precut的硝酸纤维素膜.
: 这次: 用了新配的transfer buffer, 新切的硝酸纤维素膜, 换了转膜的chamber. 相同
: 电源条件: 300mA, 1.5hr. 结果类似, 还是只有一点点转到膜上, 胶上还有不少蓝
: marker. 再用邻座小胖的reused transfer buffer, 加转1hr, 几乎没有看到任何
: improvement.
: 胶貌似没问题. 我分别做的7.5%, 9%, 12%的胶, marker泳动速度和胶浓度一致, 清清
: 楚楚分开了.
: 简单的转膜会出什么问题呢? 盒子换过了, buffer换过了, 胶新配的且跑的没见问题,
: 膜是公用and新切的...连滤纸也是以前precut好的, 一直没问题, 现在都差不多用完
| s*********t
发帖数: 600 | 5 可能是接触不良。电流300mA，你留意一下你的电压是多高？开始应该是90－100V，之
后逐渐下降到60V或者稍低。
三明治夹的紧不？膜和胶紧不？每铺一层，要用滚轴轻轻压一次。膜和胶贴的不紧也转
不过去。
缓冲液发热大不？如果太热（手伸进去感觉温或者烫）也转不好。要埋在冰里面或者加
上冰盒。
如果解决了，记得回来报告下啊。
题,
【在 g*o 的大作中提到】
: 最近连续两次, 300mA, 1.5hr, 只有少量的marker转到膜上
: 上次: 用自己4C冷藏的reused transfer buffer, 以前precut的硝酸纤维素膜.
: 这次: 用了新配的transfer buffer, 新切的硝酸纤维素膜, 换了转膜的chamber. 相同
: 电源条件: 300mA, 1.5hr. 结果类似, 还是只有一点点转到膜上, 胶上还有不少蓝
: marker. 再用邻座小胖的reused transfer buffer, 加转1hr, 几乎没有看到任何
: improvement.
: 胶貌似没问题. 我分别做的7.5%, 9%, 12%的胶, marker泳动速度和胶浓度一致, 清清
: 楚楚分开了.
: 简单的转膜会出什么问题呢? 盒子换过了, buffer换过了, 胶新配的且跑的没见问题,
: 膜是公用and新切的...连滤纸也是以前precut好的, 一直没问题, 现在都差不多用完
| g*********5
发帖数: 2533 | 6 recommend use iblot.
7min. | g*o
发帖数: 769 | 7 今天又试了下，终于转成了，不过具体原因还是不清楚
1. 换了海绵 （not likely the reason）
2. 倒掉了soak海绵的old transfer buffer，用了新buffer （not likely the reason)
3. 用了新裁的一块硝酸纤维素膜，和一张MeOH浸泡过的PVDF （maybe this is the
reason)
4. 和小胖分用不同电源，减少干扰的机会
回楼上，电源的可能性不大，原因：
1. 我用同一个电源跑胶就好好的，电源本身不该有问题
2. 昨天发现没转好，换小胖的reused buffer又转了1hr，一点改善都没有。而可以确
定，那一个小时肯定没有接触不良或电源断开之类的情况
怀疑膜可能是之前转膜失败的祸根：
昨天尽管转的很失败，还是把两块膜都1st ab过夜了，今早发现一块膜惨白（毫无任何
marker），另一块有透明感但边缘也有少许惨白的部分（弱而fussy的marker）。后者
做完了显影，脏脏的没有任何用处。前者惨白的膜就丢在PBST里，后来发现它也变的有
通透感，只中间还残余点惨白的部分，后来整块膜都变通透感，更像PVDF。而之前把它
们当作硝酸纤维素膜，没有预泡MeOH。
我之前切过PVDF，剩了些没用完，后来改裁用硝酸纤维素膜，放在之前PVDF膜上。也许
上两次都错拿了一张或两张PVDF膜。不知道是不是不预泡MeOH，PVDF会对转膜造成很大
干扰？
记得先前有个回帖还帮着分析了不少，并要求update，现在那帖不知道哪儿去了。想给
楼上几位帮忙分析的发包子感谢下，那位自删贴的可以报一下，也给你算上包子。 | y******8
发帖数: 1764 | 8 Someone probably mislabeled PVDF as Nitrocellulose.
Methanol soaking will not hurt Nitrocellulose. Just do the soaking every
time.
reason)
【在 g*o 的大作中提到】
: 今天又试了下，终于转成了，不过具体原因还是不清楚
: 1. 换了海绵 （not likely the reason）
: 2. 倒掉了soak海绵的old transfer buffer，用了新buffer （not likely the reason)
: 3. 用了新裁的一块硝酸纤维素膜，和一张MeOH浸泡过的PVDF （maybe this is the
: reason)
: 4. 和小胖分用不同电源，减少干扰的机会
: 回楼上，电源的可能性不大，原因：
: 1. 我用同一个电源跑胶就好好的，电源本身不该有问题
: 2. 昨天发现没转好，换小胖的reused buffer又转了1hr，一点改善都没有。而可以确
: 定，那一个小时肯定没有接触不良或电源断开之类的情况
| i******n
发帖数: 839 | 9 ELECTRONIC POWER-WRONG DIRECTION. EVEN MARKER DID NOT SHOW UP. | a******g
发帖数: 71 | 10 PDVF不泡methanol的话几乎不结合蛋白
reason)
【在 g*o 的大作中提到】
: 今天又试了下，终于转成了，不过具体原因还是不清楚
: 1. 换了海绵 （not likely the reason）
: 2. 倒掉了soak海绵的old transfer buffer，用了新buffer （not likely the reason)
: 3. 用了新裁的一块硝酸纤维素膜，和一张MeOH浸泡过的PVDF （maybe this is the
: reason)
: 4. 和小胖分用不同电源，减少干扰的机会
: 回楼上，电源的可能性不大，原因：
: 1. 我用同一个电源跑胶就好好的，电源本身不该有问题
: 2. 昨天发现没转好，换小胖的reused buffer又转了1hr，一点改善都没有。而可以确
: 定，那一个小时肯定没有接触不良或电源断开之类的情况
| | | h*******o
发帖数: 4884 | 11 Methoanol soaking kills nitrocellulose but activate PVDF.
Nitrocellulose membrane "melts" in methanol.
【在 y******8 的大作中提到】
: Someone probably mislabeled PVDF as Nitrocellulose.
: Methanol soaking will not hurt Nitrocellulose. Just do the soaking every
: time.
:
: reason)
| y******8
发帖数: 1764 | 12 Thanks for pointing it out.
I think both membrane can be soaked briefly with ethanol before transfer.
【在 h*******o 的大作中提到】
: Methoanol soaking kills nitrocellulose but activate PVDF.
: Nitrocellulose membrane "melts" in methanol.
| P******t
发帖数: 1717 | 13 到底咋回事儿，哪个版本正确，nitrocellulose能不能泡MeOH？
【在 y******8 的大作中提到】
: Thanks for pointing it out.
: I think both membrane can be soaked briefly with ethanol before transfer.
| y******8
发帖数: 1764 | 14 Short answer is NO.
MeOH can dissolve nitrocellulose in 10min at 37C.
I never did the soaking before transfer. But tried once after transfer with
MeOH and did not destroy the membrane at least. To be safe, don't soak
nitrocellulose in MeOH.
EtOH is not strong as MeOH. Some type of nitrocellulose is safe in EtOH.
【在 P******t 的大作中提到】
: 到底咋回事儿，哪个版本正确，nitrocellulose能不能泡MeOH？
| f*******e
发帖数: 354 | 15 meOH will definitely destroy NC Membrane
with
【在 y******8 的大作中提到】
: Short answer is NO.
: MeOH can dissolve nitrocellulose in 10min at 37C.
: I never did the soaking before transfer. But tried once after transfer with
: MeOH and did not destroy the membrane at least. To be safe, don't soak
: nitrocellulose in MeOH.
: EtOH is not strong as MeOH. Some type of nitrocellulose is safe in EtOH.
| k****o
发帖数: 589 | 16 可是我用含甲醇缓冲液(20%)，硝基纤维素膜transfer，从未出问题 |
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