k****o 发帖数: 589 | 1 最近几天用Pierce的Seize X Protein A kit做IP,要沉淀的是一个膜受体。用的抗体
(兔IgG)应该没有问题,因为做WB和flow cytometry都成功。使用了DSS让抗体和
Protein A交联。用了300~400 ug total protein沉淀,4度翻转过夜。之后清洗用的
是自己照着kit说明配的PBS,用kit自带酸性elution buffer洗脱,收集了3个组分。可
是之后用SDS-PAGE+WB检测,受体的带完全没有。我知道这个受体肯定是表达的。请问
可能原因有哪些?
另外Seize X的kit刚好用完,有没有什么其他的kit便宜质量又不错的?曾经考虑过
dynabeads,但是貌似还得另买一台磁力沉淀器?
多谢! |
g*********5 发帖数: 2533 | 2 western 合适的抗体不一定适合免疫共沉。
可能抗体识别位点在复合体内部。 |
V********n 发帖数: 305 | 3 仅供参考。
可能出的状况
1)不理解为什么要用DSS?交联后抗体是否还有活性需要检测。
2)elution buffer是否能洗脱目标蛋白?建议直接加上样buffer。
3)细胞裂解条件是否合适,IP时的buffer条件是否合适?做IP的细胞裂解条件是否和
之前WB检测时的一致。膜蛋白可能需要比较强烈的buffer条件。但同时,IP的buffer条
件可能不能太极端,需要摸条件。 |
p******i 发帖数: 1092 | 4 你用DSS是因为不想在elution里看到IgG吗?
如果你那个蛋白的size离heavy chain light chain不近,
你先试试不用cross-link做IP好了……
你elution volume是多少?都跑胶了吗?
如果volume大可以concentrate一下,全跑
这个KIT你可以自己order各个试剂,elution buffer也可以找到recipe啊
另外,顶楼上,膜蛋白不好做,搜一搜别人的paper,看用的是什么条件
IP的抗体也要多试几个……
300-400ug有点少啊,多弄点sample啊
【在 k****o 的大作中提到】 : 最近几天用Pierce的Seize X Protein A kit做IP,要沉淀的是一个膜受体。用的抗体 : (兔IgG)应该没有问题,因为做WB和flow cytometry都成功。使用了DSS让抗体和 : Protein A交联。用了300~400 ug total protein沉淀,4度翻转过夜。之后清洗用的 : 是自己照着kit说明配的PBS,用kit自带酸性elution buffer洗脱,收集了3个组分。可 : 是之后用SDS-PAGE+WB检测,受体的带完全没有。我知道这个受体肯定是表达的。请问 : 可能原因有哪些? : 另外Seize X的kit刚好用完,有没有什么其他的kit便宜质量又不错的?曾经考虑过 : dynabeads,但是貌似还得另买一台磁力沉淀器? : 多谢!
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k****o 发帖数: 589 | 5
谢谢,我用的抗体是Santa Cruz的,去查了查公司网站,发现是可以用来做IP的。
【在 g*********5 的大作中提到】 : western 合适的抗体不一定适合免疫共沉。 : 可能抗体识别位点在复合体内部。
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k****o 发帖数: 589 | 6
用DSS是为了让抗体不被洗脱,以后还可以重复用agarose beads。交联这一步我是严格
按照厂家的protocol做的。Elution buffer根据厂家描述是酸性,pH2~3。洗脱应该是
没有问题的。洗脱后没有中和pH,但是厂家说这样没有问题。细胞裂解用的是Cell
Signaling的lysis buffer,用来做相同蛋白的WB从没有问题发生过。
你是建议我用Laemmli Sample Buffer洗脱吗?这样即使洗脱,agarose beads也无法重
复用了吧?
【在 V********n 的大作中提到】 : 仅供参考。 : 可能出的状况 : 1)不理解为什么要用DSS?交联后抗体是否还有活性需要检测。 : 2)elution buffer是否能洗脱目标蛋白?建议直接加上样buffer。 : 3)细胞裂解条件是否合适,IP时的buffer条件是否合适?做IP的细胞裂解条件是否和 : 之前WB检测时的一致。膜蛋白可能需要比较强烈的buffer条件。但同时,IP的buffer条 : 件可能不能太极端,需要摸条件。
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k****o 发帖数: 589 | 7
用DSS一是不想看到IgG的带,还有就是当初想重复用agarose beads,因为IP需要的抗
体量太大了,想省钱。
洗脱体积是190 ul,IP前的total protein加了350 ug,洗脱后用了36 ul跑胶。
用那么多蛋白做IP实属无奈,我用的是原代细胞,只有那么多量。
请推荐个浓缩洗脱组分的办法吧,可以的话我打算把剩下的样全跑胶了。
【在 p******i 的大作中提到】 : 你用DSS是因为不想在elution里看到IgG吗? : 如果你那个蛋白的size离heavy chain light chain不近, : 你先试试不用cross-link做IP好了…… : 你elution volume是多少?都跑胶了吗? : 如果volume大可以concentrate一下,全跑 : 这个KIT你可以自己order各个试剂,elution buffer也可以找到recipe啊 : 另外,顶楼上,膜蛋白不好做,搜一搜别人的paper,看用的是什么条件 : IP的抗体也要多试几个…… : 300-400ug有点少啊,多弄点sample啊
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g*********5 发帖数: 2533 | 8 this company....
got good antibodies just like to draw a lottery...
【在 k****o 的大作中提到】 : : 用DSS一是不想看到IgG的带,还有就是当初想重复用agarose beads,因为IP需要的抗 : 体量太大了,想省钱。 : 洗脱体积是190 ul,IP前的total protein加了350 ug,洗脱后用了36 ul跑胶。 : 用那么多蛋白做IP实属无奈,我用的是原代细胞,只有那么多量。 : 请推荐个浓缩洗脱组分的办法吧,可以的话我打算把剩下的样全跑胶了。
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V********n 发帖数: 305 | 9 个人建议。不要光想着省试剂钱,你的时间也很值钱的。不如用最优化的条件做一遍,
得到正结果后再改进来省银子。几点你可能需要注意。
1)SC的抗体很多不靠谱。当然,也有好的。
2)最好不要用DSS。蛋白交联情况和处理时间有关,结果无法用其他实验验证。如果
是这一步的问题,你都无从查找。
3)低PH洗脱液可以从Agarose上洗脱抗体,但是否能保证打开蛋白-抗体的结合未知
,与多种因素相关。
4)你IP时的缓冲体系是什么,不会是1XCS的裂解液吧。
5)你蛋白上样太少了。直接加小体积上样Buffer煮,全上了做WB。
6)膜蛋白IP不好做。 |
i*****g 发帖数: 11893 | |
p******i 发帖数: 1092 | 11 虽然SC说抗体能IP,建议你最好用自己的sample做个routine的IP+Western试一下。确
定能IP了,再考虑CROSS LINK?
有关重复用agarose beads的问题
1 IP需要多少抗体?没觉得省很多啊……既然用的是原代细胞,你的DISSECTION和
CULTURE的人工费用应该比抗体贵很多吧
2 要确保经过 1和DSS反应 2被ELUTION buffer摧残 后的抗体仍然好用……
浓缩洗脱组分(随便换buffer或者desalt)可以用spin column,
参见
http://www.life.sci.qut.edu.au/epping/LSB607OLT/607concentrator
【在 k****o 的大作中提到】 : : 用DSS一是不想看到IgG的带,还有就是当初想重复用agarose beads,因为IP需要的抗 : 体量太大了,想省钱。 : 洗脱体积是190 ul,IP前的total protein加了350 ug,洗脱后用了36 ul跑胶。 : 用那么多蛋白做IP实属无奈,我用的是原代细胞,只有那么多量。 : 请推荐个浓缩洗脱组分的办法吧,可以的话我打算把剩下的样全跑胶了。
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k****o 发帖数: 589 | 12 多谢大家帮忙!下次试试不加DSS,浓缩洗脱组分。抗体差不多用完了,也可以换家试
试。 |
k****o 发帖数: 589 | 13
多谢,关于第四个问题,我用的是裂解液和wash/binding buffer (类似PBS) 1:1混合
。有更好的办法吗?
【在 V********n 的大作中提到】 : 个人建议。不要光想着省试剂钱,你的时间也很值钱的。不如用最优化的条件做一遍, : 得到正结果后再改进来省银子。几点你可能需要注意。 : 1)SC的抗体很多不靠谱。当然,也有好的。 : 2)最好不要用DSS。蛋白交联情况和处理时间有关,结果无法用其他实验验证。如果 : 是这一步的问题,你都无从查找。 : 3)低PH洗脱液可以从Agarose上洗脱抗体,但是否能保证打开蛋白-抗体的结合未知 : ,与多种因素相关。 : 4)你IP时的缓冲体系是什么,不会是1XCS的裂解液吧。 : 5)你蛋白上样太少了。直接加小体积上样Buffer煮,全上了做WB。 : 6)膜蛋白IP不好做。
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