k******0
发帖数: 1073 | 1 共表达两个蛋白质（40 和15kda），能够分离到复合体。
问题是，已知它们有个很短的序列（5，6个残ji）足够将两个蛋白质结合在一起，现在
想看看其他部分是否也有相互作用？
想用简单的生物物理方法来鉴定。有没有什么好办法？
好像有人用isothermal titration calorimetry（ITC），好用不好用？
谢谢解答。 |
g*********r
发帖数: 9366 | 2 ITC能够检测到蛋白binding, if there is thermo effect
但是如何检查是这里，还是那里在结合呢？
这个没啥特别简单的做法吧
对complex 进行limited digestion 能够给出定性信息
或者MS footprinting
【在 k******0 的大作中提到】
: 共表达两个蛋白质（40 和15kda），能够分离到复合体。
: 问题是，已知它们有个很短的序列（5，6个残ji）足够将两个蛋白质结合在一起，现在
: 想看看其他部分是否也有相互作用？
: 想用简单的生物物理方法来鉴定。有没有什么好办法？
: 好像有人用isothermal titration calorimetry（ITC），好用不好用？
: 谢谢解答。
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k******0
发帖数: 1073 | 3 谢谢建议。
我的想法是如果结合位点更多的话，需要更多的能量to disrupt the protein
interactions. 我有最少结合位点complex作为对照。
我不知道if there is a thermo effect.
我的结合蛋白太小了，只有15kDa，K and R rich， 进行trypsin limited digestion
好像不好用胶检测。没有MS仪器。
有没有什么光谱检测可以快速检测蛋白质相互作用情况？
【在 g*********r 的大作中提到】
: ITC能够检测到蛋白binding, if there is thermo effect
: 但是如何检查是这里，还是那里在结合呢？
: 这个没啥特别简单的做法吧
: 对complex 进行limited digestion 能够给出定性信息
: 或者MS footprinting
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t**m
发帖数: 158 | 4 gel filtration
【在 k******0 的大作中提到】
: 共表达两个蛋白质（40 和15kda），能够分离到复合体。
: 问题是，已知它们有个很短的序列（5，6个残ji）足够将两个蛋白质结合在一起，现在
: 想看看其他部分是否也有相互作用？
: 想用简单的生物物理方法来鉴定。有没有什么好办法？
: 好像有人用isothermal titration calorimetry（ITC），好用不好用？
: 谢谢解答。
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k******0
发帖数: 1073 | 5 已经知道一个motif足够将两个蛋白质结合在一起，comigrate by GF
问题是如何检测其它部分也有蛋白质相互作用？
【在 t**m 的大作中提到】
: gel filtration
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X***n
发帖数: 366 | 6 single point polarization with fluorescence. |
h****u
发帖数: 480 | 7
"Target identification using drug affinity responsive target stability (
DARTS)" can find small molecule target as well as verifying protein protein
interaction.
【在 k******0 的大作中提到】
: 共表达两个蛋白质（40 和15kda），能够分离到复合体。
: 问题是，已知它们有个很短的序列（5，6个残ji）足够将两个蛋白质结合在一起，现在
: 想看看其他部分是否也有相互作用？
: 想用简单的生物物理方法来鉴定。有没有什么好办法？
: 好像有人用isothermal titration calorimetry（ITC），好用不好用？
: 谢谢解答。
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p****s
发帖数: 3153 | 8 NMR, 这个算简单方法么？
还有就是突变了...把你觉得可能有相互作用的残基突变成alanine，做个alanine scan
，如果要看个别残基，只能用针对这些残基的方法了吧
【在 k******0 的大作中提到】
: 共表达两个蛋白质（40 和15kda），能够分离到复合体。
: 问题是，已知它们有个很短的序列（5，6个残ji）足够将两个蛋白质结合在一起，现在
: 想看看其他部分是否也有相互作用？
: 想用简单的生物物理方法来鉴定。有没有什么好办法？
: 好像有人用isothermal titration calorimetry（ITC），好用不好用？
: 谢谢解答。
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A****w
发帖数: 244 | 9 x-ray of the complex.....
Surface Plasma resonance is another method, if you heard about this.
Generally speaking, there will be some heat in binding studies especially
you are dealing with two proteins, the heat should be big enough to detect
in ITC experiments. Mutating the known sequence to ala, or just trunction
of this sequence, for another binding assay will be a way to see other
potential binding sties. According to the binding constants with /without
mutations in ITC, you may get your conclusion.BTW, ITC requires a lot of
proteins, like several millgrams. |
k******0
发帖数: 1073 | 10 多谢如上建议，听起来都是复杂的技术或工作量大。
决定做活性分析了，希望完全结合的复合体对底物更有选择性。
确认后纯化蛋白质结晶长晶体。 |
C*********m
发帖数: 213 | 11 你那个蛋白如果R/K rich用高盐，低盐跑两个gel filtration，看看复合物大小有没有
变化。如果除了那几个残基其他部分有作用的话，不同盐浓度下rentation time会有变
化。
【在 k******0 的大作中提到】
: 共表达两个蛋白质（40 和15kda），能够分离到复合体。
: 问题是，已知它们有个很短的序列（5，6个残ji）足够将两个蛋白质结合在一起，现在
: 想看看其他部分是否也有相互作用？
: 想用简单的生物物理方法来鉴定。有没有什么好办法？
: 好像有人用isothermal titration calorimetry（ITC），好用不好用？
: 谢谢解答。
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t**m
发帖数: 158 | 12 点突变一下呗, 虽然五六个氨基酸比较多, 也还是有机会的...
【在 k******0 的大作中提到】
: 多谢如上建议，听起来都是复杂的技术或工作量大。
: 决定做活性分析了，希望完全结合的复合体对底物更有选择性。
: 确认后纯化蛋白质结晶长晶体。
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o*****r
发帖数: 156 | 13 NMR will be very helpful to identify the binding sites.
Label the smaller one, do a titration with the bigger one.
If you see promising results, then go for the assignment to identify the
residues that involves in binding.
【在 k******0 的大作中提到】
: 共表达两个蛋白质（40 和15kda），能够分离到复合体。
: 问题是，已知它们有个很短的序列（5，6个残ji）足够将两个蛋白质结合在一起，现在
: 想看看其他部分是否也有相互作用？
: 想用简单的生物物理方法来鉴定。有没有什么好办法？
: 好像有人用isothermal titration calorimetry（ITC），好用不好用？
: 谢谢解答。
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