c********r
发帖数: 189 | 1 Histone H3 不应该主要在nuclei里吗？为啥我做cell fractionation, 分离nuclear和
cytoplasmic fraction, 每次western blot里cytoplasmic fraction的histone H3 最
多。
cell fractionation的问题 还是抗体的问题，还是本来就是如此？郁闷啊。 |
t**********8
发帖数: 223 | 2 我用H2A和 H2AZ做过，大部分是在nuclear。 你的lysis buffer 用的不对？
【在 c********r 的大作中提到】
: Histone H3 不应该主要在nuclei里吗？为啥我做cell fractionation, 分离nuclear和
: cytoplasmic fraction, 每次western blot里cytoplasmic fraction的histone H3 最
: 多。
: cell fractionation的问题 还是抗体的问题，还是本来就是如此？郁闷啊。
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c********r
发帖数: 189 | 3
Lysis buffer 绝对是对的，我用了好几种，而且都在显微镜下观察了。老是在
cytoplasmic fraction 一大堆的H3，太让我伤心了~
【在 t**********8 的大作中提到】
: 我用H2A和 H2AZ做过，大部分是在nuclear。 你的lysis buffer 用的不对？
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m***c
发帖数: 177 | |
V********n
发帖数: 305 | 5 H3在cyto里检测到是有可能的，但如果cyto里多，就不太对了。H3应该和DNA结合很牢
，其实并不是一个很好的Nu. marker，因为可能会造成分离假象 --- cyto fraction被
Nu protein轻微污染，但无法检测到H3。
不知道LZ如何用镜检确定的细胞fractionation。cyto里面有H3，首要怀疑的还是裂解
过程出错，buffer或者操作。
不急，慢慢来。 |
c********r
发帖数: 189 | 6
其实还是主要和DNA结合的，从这篇文章来看
【在 m***c 的大作中提到】
: H3 can be in cytoplasma. Take a look this referencef, http://www.nature.com/cr/journal/v15/n2/full/7290276a.html.
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c********r
发帖数: 189 | 7
其实我要检测的是nuclear里的chromatin bound protein，所以histone H3比较好。我
在裂解之前，先count细胞，然后裂解细胞膜后，count nuclei （这时候nuclei可以被
stain）至少90%的细胞裂解了而且保有完整的细胞核。结果cyto里还有Histone H3，于
是我就无语了
【在 V********n 的大作中提到】
: H3在cyto里检测到是有可能的，但如果cyto里多，就不太对了。H3应该和DNA结合很牢
: ，其实并不是一个很好的Nu. marker，因为可能会造成分离假象 --- cyto fraction被
: Nu protein轻微污染，但无法检测到H3。
: 不知道LZ如何用镜检确定的细胞fractionation。cyto里面有H3，首要怀疑的还是裂解
: 过程出错，buffer或者操作。
: 不急，慢慢来。
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V********n
发帖数: 305 | 8 嗯，如果是这样的话，H３是很好的marker。
俺还是觉得问题出在细胞裂解，不知道你镜下观测细胞核用的是什么染色。如果是直接
bind到DNA上的如DAPI之类，只要DNA不被降解，都可以染出来，无法提示你关于
fractionation的信息。
如果你还是相信你的操作，做个H３的IF看看。也许是重大发现？ |
y*********1
发帖数: 46 | 9 What about doing western with anti-H3K4me3 antibodies? There are some very
good antibodies for both western and ChIP. |
b**j
发帖数: 415 | 10 理论是可以，但一般paper里少有人用这个当marker
【在 c********r 的大作中提到】
: Histone H3 不应该主要在nuclei里吗？为啥我做cell fractionation, 分离nuclear和
: cytoplasmic fraction, 每次western blot里cytoplasmic fraction的histone H3 最
: 多。
: cell fractionation的问题 还是抗体的问题，还是本来就是如此？郁闷啊。
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S******e
发帖数: 36 | 11 我曾经试过用不同的方法裂解细胞，比方说用低渗Buffer(10 mM HEPES (pH 7.9), 10
mM KCl, 1.5 mM MgCl2）溶胀细胞后，dounce 10次或者加1%NP40，每次我都用普通的
相差显微镜检查过细胞，溶胀后细胞膜没破，但Dounce或者加入NP40后，90%以上细胞
膜破掉，细胞核似乎还是完整的。可是当做WB时候，很多只在核内的蛋白（比方说转录
因子）都可以明显的在cyto的fraction里边检测到，我估计还是有渗漏。你能检测到H3
可能也是这个原因？ |
c********r
发帖数: 189 | 12
10
H3
最后发现时H3 抗体的问题，换了种抗体，好了，一般来说transcription factor和
Histone 之类的都应该主要在nuclear fraction里
【在 S******e 的大作中提到】
: 我曾经试过用不同的方法裂解细胞，比方说用低渗Buffer(10 mM HEPES (pH 7.9), 10
: mM KCl, 1.5 mM MgCl2）溶胀细胞后，dounce 10次或者加1%NP40，每次我都用普通的
: 相差显微镜检查过细胞，溶胀后细胞膜没破，但Dounce或者加入NP40后，90%以上细胞
: 膜破掉，细胞核似乎还是完整的。可是当做WB时候，很多只在核内的蛋白（比方说转录
: 因子）都可以明显的在cyto的fraction里边检测到，我估计还是有渗漏。你能检测到H3
: 可能也是这个原因？
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v*******a
发帖数: 759 | 13 能说一下换了哪里的吗?
【在 c********r 的大作中提到】
:
: 10
: H3
: 最后发现时H3 抗体的问题，换了种抗体，好了，一般来说transcription factor和
: Histone 之类的都应该主要在nuclear fraction里
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c********r
发帖数: 189 | 14 Histone H3 不应该主要在nuclei里吗？为啥我做cell fractionation, 分离nuclear和
cytoplasmic fraction, 每次western blot里cytoplasmic fraction的histone H3 最
多。
cell fractionation的问题 还是抗体的问题，还是本来就是如此？郁闷啊。 |
t**********8
发帖数: 223 | 15 我用H2A和 H2AZ做过，大部分是在nuclear。 你的lysis buffer 用的不对？
【在 c********r 的大作中提到】
: Histone H3 不应该主要在nuclei里吗？为啥我做cell fractionation, 分离nuclear和
: cytoplasmic fraction, 每次western blot里cytoplasmic fraction的histone H3 最
: 多。
: cell fractionation的问题 还是抗体的问题，还是本来就是如此？郁闷啊。
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c********r
发帖数: 189 | 16
Lysis buffer 绝对是对的，我用了好几种，而且都在显微镜下观察了。老是在
cytoplasmic fraction 一大堆的H3，太让我伤心了~
【在 t**********8 的大作中提到】
: 我用H2A和 H2AZ做过，大部分是在nuclear。 你的lysis buffer 用的不对？
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m***c
发帖数: 177 | |
V********n
发帖数: 305 | 18 H3在cyto里检测到是有可能的，但如果cyto里多，就不太对了。H3应该和DNA结合很牢
，其实并不是一个很好的Nu. marker，因为可能会造成分离假象 --- cyto fraction被
Nu protein轻微污染，但无法检测到H3。
不知道LZ如何用镜检确定的细胞fractionation。cyto里面有H3，首要怀疑的还是裂解
过程出错，buffer或者操作。
不急，慢慢来。 |
c********r
发帖数: 189 | 19
其实还是主要和DNA结合的，从这篇文章来看
【在 m***c 的大作中提到】
: H3 can be in cytoplasma. Take a look this referencef, http://www.nature.com/cr/journal/v15/n2/full/7290276a.html.
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c********r
发帖数: 189 | 20
其实我要检测的是nuclear里的chromatin bound protein，所以histone H3比较好。我
在裂解之前，先count细胞，然后裂解细胞膜后，count nuclei （这时候nuclei可以被
stain）至少90%的细胞裂解了而且保有完整的细胞核。结果cyto里还有Histone H3，于
是我就无语了
【在 V********n 的大作中提到】
: H3在cyto里检测到是有可能的，但如果cyto里多，就不太对了。H3应该和DNA结合很牢
: ，其实并不是一个很好的Nu. marker，因为可能会造成分离假象 --- cyto fraction被
: Nu protein轻微污染，但无法检测到H3。
: 不知道LZ如何用镜检确定的细胞fractionation。cyto里面有H3，首要怀疑的还是裂解
: 过程出错，buffer或者操作。
: 不急，慢慢来。
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V********n
发帖数: 305 | 21 嗯，如果是这样的话，H３是很好的marker。
俺还是觉得问题出在细胞裂解，不知道你镜下观测细胞核用的是什么染色。如果是直接
bind到DNA上的如DAPI之类，只要DNA不被降解，都可以染出来，无法提示你关于
fractionation的信息。
如果你还是相信你的操作，做个H３的IF看看。也许是重大发现？ |
y*********1
发帖数: 46 | 22 What about doing western with anti-H3K4me3 antibodies? There are some very
good antibodies for both western and ChIP. |
b**j
发帖数: 415 | 23 理论是可以，但一般paper里少有人用这个当marker
【在 c********r 的大作中提到】
: Histone H3 不应该主要在nuclei里吗？为啥我做cell fractionation, 分离nuclear和
: cytoplasmic fraction, 每次western blot里cytoplasmic fraction的histone H3 最
: 多。
: cell fractionation的问题 还是抗体的问题，还是本来就是如此？郁闷啊。
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S******e
发帖数: 36 | 24 我曾经试过用不同的方法裂解细胞，比方说用低渗Buffer(10 mM HEPES (pH 7.9), 10
mM KCl, 1.5 mM MgCl2）溶胀细胞后，dounce 10次或者加1%NP40，每次我都用普通的
相差显微镜检查过细胞，溶胀后细胞膜没破，但Dounce或者加入NP40后，90%以上细胞
膜破掉，细胞核似乎还是完整的。可是当做WB时候，很多只在核内的蛋白（比方说转录
因子）都可以明显的在cyto的fraction里边检测到，我估计还是有渗漏。你能检测到H3
可能也是这个原因？ |
c********r
发帖数: 189 | 25
10
H3
最后发现时H3 抗体的问题，换了种抗体，好了，一般来说transcription factor和
Histone 之类的都应该主要在nuclear fraction里
【在 S******e 的大作中提到】
: 我曾经试过用不同的方法裂解细胞，比方说用低渗Buffer(10 mM HEPES (pH 7.9), 10
: mM KCl, 1.5 mM MgCl2）溶胀细胞后，dounce 10次或者加1%NP40，每次我都用普通的
: 相差显微镜检查过细胞，溶胀后细胞膜没破，但Dounce或者加入NP40后，90%以上细胞
: 膜破掉，细胞核似乎还是完整的。可是当做WB时候，很多只在核内的蛋白（比方说转录
: 因子）都可以明显的在cyto的fraction里边检测到，我估计还是有渗漏。你能检测到H3
: 可能也是这个原因？
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v*******a
发帖数: 759 | 26 能说一下换了哪里的吗?
【在 c********r 的大作中提到】
:
: 10
: H3
: 最后发现时H3 抗体的问题，换了种抗体，好了，一般来说transcription factor和
: Histone 之类的都应该主要在nuclear fraction里
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c****g
发帖数: 93 | 27 我们用这个lysis buff：
10 mM HEPES/KOH, pH7.6
1.5mM MgCl 2
10 mM KCl
5 mM EDTA
5 mM EGTA
250 mM Sucrose
Adjust pH 7.6 with 10N KOH
然后过过15次#7 needle，低速离心后上清基本是cytosol，无nuclear protein。
10
H3
【在 S******e 的大作中提到】
: 我曾经试过用不同的方法裂解细胞，比方说用低渗Buffer(10 mM HEPES (pH 7.9), 10
: mM KCl, 1.5 mM MgCl2）溶胀细胞后，dounce 10次或者加1%NP40，每次我都用普通的
: 相差显微镜检查过细胞，溶胀后细胞膜没破，但Dounce或者加入NP40后，90%以上细胞
: 膜破掉，细胞核似乎还是完整的。可是当做WB时候，很多只在核内的蛋白（比方说转录
: 因子）都可以明显的在cyto的fraction里边检测到，我估计还是有渗漏。你能检测到H3
: 可能也是这个原因？
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